由于未经灭菌处理的培养基既可能带有各种杂菌，同时又是各种杂菌良好的生长繁殖场所，因此培养基分装后应立即置于灭菌锅内进行灭菌。若不能及时灭菌，最好放入冰箱或冰柜中，在24h内完成灭菌工作。消毒灭菌时，压力表读数为1.1kgf・cm-2或0.1MPa，121℃时保持15min左右即可。为了保证灭菌彻底，在蒸气灭菌锅增压前应先将灭菌锅内的冷空气放尽。排净冷空气的办法可选用下列办法之一：可以事前打开灭菌锅放气阀，煮沸15min后再关闭或等大量热蒸气排出后再关闭；也可采用先关闭放气阀，待压力升到0.5kgf・cm-2或0.05MPa时打开放气阀排出空气，再闭放气阀。培养基消毒灭菌时间不宜过长，也不可超过灭菌锅规定的压力范围；否则，培养基中的蔗糖、有机物质，特别是维生素类物质就会分解，导致培养基变质、变色，甚至难以凝固。当灭菌完成后，应切断电源或热源，待灭菌锅内气压接近“0”时，方可打开放气阀，拧开灭菌锅盖取出培养基。切勿为急于取出培养基而打开放气阀放气，否则锅内气压下降太快会引起减压沸腾，导致灭菌锅内各容器中的培养基溢出，造成浪费或污染，甚至烫伤工作人员。

对于吲哚乙酸、玉米素及某些维生素等遇热不稳定的生物活性物质，不能进行高压蒸气灭菌，而必须采用过滤方法灭菌。通常采用减压过滤装置和过滤灭菌器，前者主要由过滤器和抽气系统两部分构成。用一个弹性夹钳将两部分结合起来，用真空泵或电动吸引器使液体从布氏漏斗经滤膜流到抽滤瓶中。后者需在超净工作台上进行，适合少量溶液过滤。但所有器皿事先均应高温蒸气灭菌。当高压灭菌后的琼脂培养基温度下降到大约40-50℃（感觉不烫手）时，可把已经过滤灭菌的溶液加入。
高压灭菌后的培养基凝固后，宜将培养基放到培养室中预培养2-3d，若没有杂菌污染才可放心使用。暂时不用的培养基应放置于10℃下保存，而含有生长调节物质的培养基在4-5℃低温下保存更佳。含吲哚乙酸或赤霉素的培养基应在配制灭菌后1周内用完，其他培养基应该在消毒后2周内用完，至多不超过1个月，以免培养基干燥变质（图3-3）。