配制培养基时先将贮存母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿、量筒、烧杯、移液管、玻璃棒、漏斗等放在指定的位置。首先称好所需的琼脂、蔗糖，配好所需用的生长调节物质。准备好重蒸馏水及作瓶盖的棉塞、牛皮纸和包装线等。由于琼脂较难溶解，所以要及早加热溶解。先在烧杯挤乓欢量的蒸馏水，以免加入药液时溅出。再按母液顺序，根据不同母液的不同倍数取规定的量。在加入母液或生长调节物质时，应事先检查这些母液等是否已变色或产生沉淀或产生结晶，已失效的就不要取用。加完后一并倒入已溶化的琼脂中，再放入蔗糖，定容至所需体积，继续加温并６辖涟瑁待琼脂煮透后端离火源，根据培养基配方及培养基体积加入所需要的生长调节物质。由于培养基的PH值直接影响到培养物对离子的吸收，因而过酸或过碱都对植物材料的生长有很大影响；此外，琼脂培养基的PH值还影响到凝固情况。所以，当培养基配制好后应立即进行PH值的调整Ｗ詈糜盟岫燃撇馐裕既快又准，如无条件也可用精密PH试纸，但最好多用一两种试纸同时测定，免得一种PH试纸偏差太大而明显影响外植体的生长。培养基若偏酸时用1 mol・L-1NaOH来调节，偏碱则可用1 mol・L-1HCl来调节。培养基的PH值一般都是调节到5.0-6.0。一般来说，当PH值高于6.0时，培养基将会变硬；PH值低于5.0时，琼脂不能很好的凝固。PH值对不同植物的影响会有差异，如玉米胚乳愈伤组织在PH值7.0时鲜重增加最快，在PH值6.1时干重增长最快。
配制好的培养基要趁热分装，分装时可采用烧杯漏斗直接分注。一般以占试管、三角瓶等培养容器的1/4-1/3为宜。太多则浪费培养基，又减少了培养材料的生长空间；太少又会因营养不良影响生长。使用不透气的封口膜时，因其水分蒸发较慢，培养基可以少些；要用透气性好的封口膜就得适当厚一些。已经分装的培养基应该做好标记，以免在灭菌和使用时混淆，是培养物生长出现异常。当用试管制备琼脂固化培养基时，最好把试管斜置，将培养基制成斜面，为外植体的生长提供一个较大的面积，又便于观察生长效果。在大规模生产中可以用分装机分装，这样可以提高工作效率并使培养基分装均匀。操作时要尽量避免培养基粘到容器瓶口上，以免引起污染。