原生质体的分离与纯化
（一）外植体的选择,要获得高质量的原生质体，应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。植物的年龄、季节、光照、肥水条件等都明显影响原生质体的质量。普遍采用的外植体有限、下胚轴、幼叶、子叶等，生长在温室里的植株较好。不少人采用叶肉细胞分离原生质体，其优点是来源方便，供应及时，有明显的叶绿体，也便于在融合中认识。禾本科植物中，常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料。最适宜的细胞是处于对数生长早期l细胞。在酶解游离原生质体之前对植株进行预处理，有时可提高原生质体培养中的分离频率。预处理的方式有暗处理、低温处理或预先在组织培养的培养基上进行预培养。
（二）外植体灭菌,与组织培养中的外植体灭菌相同。
（三）酶解处理,不同植物对不同酶类的浓度是不同的。表14-1是常用的酶类和浓度，可供参考。对茄科、豆科等的幼叶来说，需要较低浓度，0.5％-1.0％纤维素酶就够了；而果胶酶可更低些（0.2％-0.5％），但是对愈伤组织、悬浮细胞、冠瘿细胞来说，纤维素酶、果胶酶的浓度要提高到1％或2％。现举几种材料的酶液全部成分如下表14－2所示。
表14－1 不同植物原生质体所用酶的种类及浓度（％）
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酶种类 |
豇豆 |
烟属 |
洋地黄 |
冠瘿瘤 |
甘蔗 |
小麦 |
大白菜 |
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果胶酶（ macerozyme R-10 ） |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.6 |
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0.6 |
0.2 |
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Pectolyase Y － 23 |
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0.05 |
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纤维素酶（ Onozuka R-10 ） |
1.0 |
0.5 |
1.0 |
2 |
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0.5 |
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纤维素酶（ Driselase ） |
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0.2 |
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纤维素酶（ Panda EA 3 867 ） |
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2 |
2 |
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CaCl 2 ・2H 2 O （ mmol・L -1 ） |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
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KH 2 PO 4 （ mmol・L -1 ） |
0.7 |
0.7 |
0.7 |
0.7 |
0.7 |
0.7 |
0.7 |
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MES |
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0.5 |
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甘露醇 （ mmol・L -1 ） |
0.5 |
0.6 |
0.55 |
0.5 |
0.4 |
0.5 |
0.6 |
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pH 值 |
5.6 |
5.6 |
5.6 |
5.6 |
5.6 |
5.6 |
5.6 |
表 14 － 2 几种酶液的组成成分
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材料 |
酶液成分 |
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小麦悬浮细胞 |
CaCl 2 ・2H 2 O 1470mg・L -1 ， KH 2 PO 4 95mg・L -1 ， MES 600mg・L -1 ， 甘露醇 0.5mol・L -1 ， pH 值 5.6 |
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水稻悬浮细胞 |
CaCl 2 ・2H 2 O 1470mg・L -1 ， KH 2 PO 4 95mg・L -1 ， MES 600mg・L -1 ， 甘露醇 0.4mol・L -1 ， pH 值 5.6 Onozuka R － 10 1 ％， Onozuka RS 0.5 ％，离析酶 R － 10 1 ％， Pectolyase Y23 0.1 ％ |
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玉米悬浮细胞 |
CaCl 2 ・2H 2 O 1470mg・L -1 ， KH 2 PO 4 95mg・L -1 ， MES 600mg・L -1 ， 甘露醇 0.5mol・L -1 ， pH 值 5.6 Onozuka RS 3 ％，离析酶 R － 10 0.5 ％， Pectolyase Y23 0.1 ％，半纤维素酶 0.5 ％ |
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哈密瓜子叶 |
CaCl 2 ・2H 2 O 1470mg・L -1 ， KH 2 PO 4 95mg・L -1 ， MES 600mg・L -1 ， 甘露醇 0.4mol・L -1 ， pH 值 5.6 Onozuka R － 10 1 ％，离析酶 R － 10 1 ％ |
酶解处理一般静置在黑暗中进行，也可偶尔轻摇，较难分离时，可置于摇床上低速振荡。酶解时间因材料而不同，几小时到十几小时不等，但不宜超过24小时。酶解温度一般为25-27℃。
（四）原生质体的收集和纯化
酶解处理后得到混合液包括原生质体、细胞团和组织碎片等，必须将杂质和酶液除去，才可以继续培养。收集和纯化方法大致是：用40-100um的滤网过滤混合液，去除杂质，收集滤液。将滤液以┦嚼胄幕75-100g离心3-5min，弃去上清液，沉淀物可采用下列两种方法之一进一步纯化：
1. 沉淀物重新悬浮于清洗培养基（不含酶，其它成分同酶液）中，在50g下离心3-5min后再悬浮，如此反复洗涤2-3次。
2. 为了纯化出有生活力的原生质体，将沉淀悬浮于少量清洗培养基，置于含有蔗糖溶液（21％）的上部，在100g下离心5-10min后，在蔗糖溶液和原生质体悬浮培养基的界面上会出现一个纯净的原生质体带，小心将此吸出后，再反复洗涤2次，最后用原生质体培养基洗一次。用Percoll或Ficoll（Sigma产品）进行纯化效果更佳。
将纯化后的原生质体调整到细胞密度为2×105个/ml，进行继后的培养。在原生质体培养之前，常常先对原生质体的活性进行硬狻３Ｓ玫姆椒ㄓ泄鄄彀质环流、荧光素双醋酸酯（FAD）染色等方法。
