五、原生质体培养
（一）培养基
原生质体的培养和组织、细胞培养相似。由于除去了细胞壁，培养基中必须有一定浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定。原生质体培养基有多种。李向辉等（1982）建立一种能广泛适用的D2a植物原生质体培养基，适用于茄科、玄参科、豆濉⑥伎频戎参铩５痹偕细胞形成细胞系后进入旺盛分裂时，除去葡萄糖并及时补充蔗糖，即形成D2b培养基（表14-3）。此外，高国楠等（Kaoetal，1977）提出的KM-8P培养基和B5培养基等对某些植物也行之有效，一般来说，无机盐的大量元素含量稍低，钙离子浓度较高，采用有机氮源而少用铵盐。在培养基中添加天然有机物质如椰汁、酵母提取物等对原生质体的生长有利。不同的植物对激素的种类和浓度要求不同。常采用1－2 mg•L-12，4－D或配以低浓度（0.2-0.5 mg•L-1）的玉米素。
表14-3 原生质体D2a和D2b培养基的成分

（二）培养方法
原生质体的培养方法有液体培养、固体培养和固液混合培养等三种。①液体培养又可分为微滴培养和浅层培养两种。微滴培养是将悬浮的密度为每毫升104-105个原生质体的培养液用滴管以0.1ml左右的小滴一滴一滴的接种到培养皿上，由于表面张力的作用，小滴以半球形保持在培养皿表面，如果逝嘌皿翻转过来，则成为悬滴培养。微滴培养的优点是如果其中一滴或几滴发生污染，不会殃及整个实验。缺点是原生质体分布不均匀，集中在小滴中央，且与空气接触面大，液体容易蒸发，使培养基浓度提高。液体浅层培养是一种有效方法，将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄省Ｒ翰悴灰太厚，以免通气不良而导致原生质体不易分裂。②固体培养是将悬浮在液体培养基中的原生质体悬液与热融的含琼脂的培养基在一定的温度（45℃）下等量混合。琼脂冷却固定后，原生质体就埋在培养基内培养。用琼脂糖代替琼脂可提高植板效率，特别是对一些不容易发生分裂试生质体。这种方法的优点是可以在倒置显微镜下定点的观察一个原生质体的分裂情况；缺点是只有在固体表面的原生质体才能分裂，埋在琼脂内部的因通气不良而不分裂。③固液混合培养是在培养皿底部先铺上一层琼脂培养基，待固化以后，在固体培养基表面再作浅层液体培养。
（剩┡嘌条件
1. 保持湿度是培养的关键因子。因为培养基的用量很少，水分稍为蒸发就会引起渗透压提高，原生质体就受影响。因此培养皿必须严密封住，并放在能保持湿度的容器内。
2. 各种植物原生质体要求不同的最适温度，一般可在25℃上下。在光照方面，多数原生质体适合拾档的散射光下或黑暗中生长。
3. 原生质体培养要求有较高的密度，具体密度因植物材料、物种及基因型不同而异。一般培养密度是104-105个/ml，太密太疏都不好。例如大豆子叶原生质体培养最适密度是1×105个/ml左右，当密度达到5×105个/ml时，原生质体分裂明显受抑制，逐渐破碎解体；但密度较低时（0.5×105个/ml），不利于快速得到愈伤组织。
4. 原生质体培养了一段时间后，要添加新鲜培养基，并且逐步用较低渗透压的细胞培养基代替，以便适应新细胞团或愈伤组织的生长。
（四）原生质体的发育
原生质体在适合的条件下，首先形成新的细ケ冢继而进行分裂，形成愈伤组织。
茄科植物如烟草、矮牵牛等叶肉细胞原生质体在D2a培养基上首先增大体积，叶绿体重排于细胞核周围，在短时间合成新细胞壁，细胞由球形变成长椭圆形。在1-2天内便形成完整的细胞壁。新形成的细胞壁可用质壁分离显示，或用荧光染料显示。
如果培养基合适，培养2-3天后胞质增加，RNA、蛋白质及多聚糖合成增加，不久即发生核的有丝分裂和胞质分裂，形成细胞团或愈伤组织。第一次细胞分裂的时间因植物材料和培养条件而定，大约是培养后2-10天。虽然细胞有分裂能力，但不一定能继续分裂下去。例如茄科和豆科等植物能不断分裂，而禾本科的小麦叶肉原生质体只能分裂2-3次，大麦也只能分裂5-6次。
虽然每个原生质体都有再生分裂的潜在能力，但在培养基中只有一部分能分裂。除植物种类基因型外，还主要取决于培养基的培养条件。烟草叶肉原生质体在NT培养基上培养一周，分裂频率（植板率）为54.9％，如在2N-11培养基上培养同样时间，则可达82.8％。待小愈伤组织长至1mm左右时，及时将其转入固体培养基上使其进一步生长。培养基组成一般与愈伤组织培养基相同。
（五）原生质体植株再生
原生质体分化为再生植株通过两种途径：一种途径是将原生质体再生的愈伤组织直接转移到分化培养基上，一步成苗。关键是选择适合的培养基并调节生长素和激动素的平衡。另一种途径是由先将愈伤组织培养在含细胞分裂素（一般为0.5-2.0 mg•L-1）和低浓度2，4-D（一般为0.02-0.2 mg•L-1）的分化培养基上，形成质地较硬的胚性愈伤组织或胚状体，再将其转到含细胞分裂素的分化培养基上再生植株。