(1)基因型 通过长期的品种选育形成了花色、花型及其栽培性状显著不同的香石竹品种类型。不同香石竹品种的栽培性状表现不同,同样不同香石竹品种在组培中,其s状的表现也存在着普遍的差异,这些差异表现在愈伤组织诱导、不定芽再生及丛芽增殖等个方面。如Mubarack等指出不同的品种愈伤组织诱导差异明显,通过对多个品种进行试验,结果Shock Pink产生愈伤组织比其他品种早7.3d,作用于愈伤组织最重。Choudhary等也指出不同品种形成愈伤组织的时间不同,而且从品种William Sim的愈伤组织上未得到丛芽再生。Kallak等还进一步对基因型及生长调节剂与形态发生的关系进行了研究。另外基因型的影响还表现在不同品种的增殖率差异很大。作者多年从事香石竹的组培研究与生产,通过对上百个品种的试验和实践也认为,扦插繁殖系数高的品种其组培增殖率一般也较高。
(2)外植体 目前已从茎尖、腋芽、茎段、叶片、花瓣、萼片、胚珠、花粉、原生质体及细胞等多种外植体中获得了再生植株。不同外植体其再生增殖能力各不相同,即使同一外植体在不同年龄阶段也会表现出差异。Miller等人利用腋芽得到了不定丛生芽,但从叶片及茎断外植体上未得到芽的再生。Sankhla用叶片、茎间、花瓣、萼片、体细胞进行试验比较后认为,花瓣及花萼的再生潜力最大。另外外植体发生芽的方式,既有不定丛生芽的直接发生,也有先形成愈伤组织,然后再进一步分化形成不定芽,后者容易发生体细胞的变异。外植体的生理年龄对芽的诱导和再生也有明显的影响,幼嫩的茎叶及未成熟的花瓣诱导和再生效果较好,特别是近项部的第二对叶,表现出相对较强的再生优势。生理年龄大的外植体容易产生花摹;ㄆ鞴僮魑外植体,特别是花瓣和花托极易诱导花芽产生。目前对试管苗开花的机理仍无一致的看法。采用胚珠、花粉及原生质体培养的主要目的,是获得单倍体及多倍体植株,但目前这方面的研究和运用还比较少。
(二)有效的培养方法
1、培养基配方
诱导培养基 MS+BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L。
增殖培养基 MS+BA 0.2mg/L+KT0.2mg/L+NAA 0.1mg/L。
生根培养基 1/2 MS+NAA 0.5mg/L:
2、培养程序
(1)取材 香石竹的组培虽然可以通过多种外植体进行,但在生产应用中,从快速高效的角度出发,常用营养枝的顶芽约1cm作为外植体最为有效。由于香石竹在田间的病害比较严重,特别是香石竹病毒病发生普遍,进行组织培养的目的主要是通过茎尖培养脱去病毒病b生产组培苗作为母本植株,用于培育扦插苗。所以在选择材料时,首先要选取植株健康无病虫害症状,生长势强,叶色浓绿,品种优良,花色艳丽,商品性状好的优良单株作为取芽植株。其次,要选择基部粗壮、干净的新芽,最好是首次打顶后萌发出来的嫩芽(植株上部的芽一方面是已经b化,最重要的是已开始分化花芽,这种芽经组培后分化出来的芽仍然是花芽)。取芽一般在上午进行,将芽取回后逐层剥去叶片,在这个过程中要特别注意不要将表皮一起撕掉,剥到还剩1~2对幼叶时,用利刀切去茎段及叶梢,保留顶芽1cm左右待用。
(2)灭菌 将上述材料放入容器内,在自来水冲洗干净,然后在洗衣粉水中搅动摇洗,并用清水洗净,放入0.1%~0.2%的HgCl2溶液中灭菌15~20min,也可在2%的次氯酸钠溶液中消毒15min,最后取出在无菌水中漂洗3次。
(3)生长及分化 将已经灭菌的外植体直接接种或是剥离茎尖(0.1~0.5mm)后接种于诱导培养基上。原则上,如果在采样时已经过病毒检测,证实采样单株不含病毒,则可以将顶芽直接接种在培养基上;若是未经过病毒检测或是经过检测证实外植体带病毒,则要剥离茎尖进行p离培养。剥取茎尖的方法是在无菌条件下,将无菌外植体放在25~30倍的解剖镜下,先用针将顶芽固定在橡皮塞上,用解剖刀轻轻剥除外层嫩叶(茎叶交界处非常幼嫩,在操作中应注意不要将茎过早的弄断,否则难于剥离)。嫩叶剥去后可看见茎尖露出,用利刀切下0.2~0.4mm的茎尖生长点,快速的转移到培养基上。为防茎尖失水死亡,操作要相当熟练。为了熟练掌握剥离茎尖的操作技巧,必须在解剖镜下进行多次反复练习操作的基本功。
不同的研究者所使用的培养基、培养程序及激素用量等不一定相同。Davis等人(1977)试验了MS、B5、Heller、Nitsch以及Whiter等9种培养基,均加入KT2.15mg/L和NAA0.018mg/L,然后比较将香石竹的茎尖在各个培养基上培养4周后的重量,结果MS培养基最好。MS是适用广泛的一种培养基,它适宜于不同的花卉、不同部位、不同阶段的组织培养。有人比较了MS和N6固体与液体培养基的培养效果后,认为MS液体培养基添加KT 1mg/L进行滤纸桥培养,是香石竹茎尖培养的最好培养基。
多数人采用的茎尖脱毒培养的程序,是将茎尖培养在MS+BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L的培养基上。茎尖接种后3~4d,芽点开始转绿,1周后膨大,25~40d后开始展叶,转瓶于相同的培养基上,2个月后进一步长成2~3cm基部带小芽的丛状芽。这时可进行病毒检测,进一步淘汰带毒个体,将无毒个体作为原原种进行组培快繁,一株原原种在一年内,可以繁殖上千株,经过原种扩繁,并生根出瓶,作为母本植株栽培进行扦插苗生产,可用于形成p模上千万的种苗生产基地。
培养香石竹组培苗最快的方法,是用无毒植株的顶芽在诱导培养基(BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L)中诱导出丛生芽,在增殖培p基(MS+BA 0.2~0.5mg/L+NAA0.1~0.3mg/L)上进行继代培养。香石竹的继代培养采用茎段增殖的方式进行,根据不同的品种,所采用的培养基有所不同,而且各个品种的增殖率也不完全一样。
无论是用脱毒个体进行增殖扩繁,还是用无毒植株的顶芽诱导的丛生芽进行增殖扩繁,生产出的原种组培苗,在作为母本植株栽培的同时,要间隔均匀地选择单株进行开花鉴定,在确保遗传稳定性的前提下,才能要穗进行扦插苗生产。
(4)生根培养 待继代增殖苗繁殖够一定的基数后,即可进行生根培养。将高度达到2cm左右,生长正常的小芽切下<接种于生根培养基中,10d左右即可长出根原基和细根。多数品种转入生根培养基后,12~15d便可以出瓶移栽。香石竹生根培养对生长素浓度的要求不太严格,NAA 0~1mg/L都可以获得很好的生根效果。