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培养材料灭菌
发布时间:2018-06-15

从外界或室内选取的植物材料,都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基,便会造成培养基污染。因此,植物材料必须经严格的表面灭菌处理,再经无菌操作手续接到培养基上,这一过程叫做接种。
第一步,将采来的植物材料除去不用的部分,将需要的部分仔细洗干净,如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小,即灭菌容器能放入为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时,冲洗时间视材料清洁程度而定。易漂浮或细小的材料,可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。
洗时可加入洗衣粉清洗,然后再用<来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物,除去脂质性的物质,便于灭菌液的直接接触。当然,最理想的清洗物质是表面活性物质―吐温。
第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成,准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸10~30s。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用,加之70%酒精穿透力强,也很易杀伤植物细胞,所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料,如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗,多层鳞片的休眠芽等等,以及主要取用内部的材料,则可只用70%酒精处理稍⒌氖奔洹4理完的材料在无菌条件下,待酒精蒸发后再剥除外层,取用内部材料。
第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多,可根据情况选取1-2种使用见表。

上述灭菌剂应在使用前临时配制,氯化汞可短期内贮用。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌的,故灭菌时用广口瓶加盖较好;升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的;过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的,这种药剂残留的影响较小,灭菌后用无菌水涮洗3-4次即可;由于用升汞液灭菌的材料,难以把升汞残毒去除,所以应当用无菌水涮洗8~10次,每次不少于3min,以尽量去除残毒。
灭菌时,把沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中,记好时间,倒人消毒溶液,不时用玻璃棒轻轻搅动,以促进材料各部分与消毒溶液充分接触,驱除气泡,使消毒彻底。在快到时间之前1-2min,开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内,要注意勿使材料倒出,倾净后立即倒入无菌水,轻搅涮洗。灭菌时间是从倒人消毒液开始,至倒入无菌水时为止。记录时间以便于比较消毒效果,以便改正。灭菌液要充分浸没材料,宁可多用些灭菌液,切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很-材料灭菌。
在灭菌溶液中加吐温-80或Tnton X效果较好,这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布,更容易浸人到灭菌的材料表面。但吐温加人后对材料的伤害也在增加,应注意吐温的用量和灭菌时间,一般加入灭菌液的0.5%,即在100ml加入15滴。
最后一步是用无菌水涮洗,涮洗要每次3min左右,视采用的消毒液种类,涮洗3-l0次左右。无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。
把植物材料在消毒液中浸泡,一般先在70%的酒精中浸泡30秒,再转入0.1%的升汞中浸泡10分钟或用10%的漂白粉上清液浸泡10-15分钟,最后用无菌水冲洗3遍以上。
注意:①酒精渗透性强,幼嫩材料易在酒精中失绿,所以浸泡时间要短,防止酒精杀死植物细胞。②老熟材料,特别是种子等可以在酒精中浸泡时间长一些,如种子可以浸泡5分钟。③升汞的渗透力弱,一般浸泡10分钟左右,对植物材料的杀伤力不大。④漂白粉容易导致次锊牧鲜绿,所以对于幼嫩材料要慎用。⑤在消毒液中加入浓度为0.08-0.12%的吐温20或80(一种湿润剂),可以降低植物材料表面的张力,达到更好的消毒效果。

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