1、实验方案的设计

1）、单因子实验设计：单因子实验是组织培养中最常用的实验方法, 尤其在选择适当的激素种类和浓度配比上使用最多。

2 ）、正交实验设计植物离体培养的成功是由多种因素决定的。正交设计是多因素分析的有力工具, 它可以很方便的从众多因素中选出主要影响因素及最佳水平, 因为它可以用较少的实验次数到较多的信息。例如, 一个7 因素水平的实验, 若将各因素水平全部组合都做一遍, 需要27 = 128 次, 而正交设计只需做8 次实验就可以了, 虽然实验次数减少了, 但因为各因素水平搭配均匀, 8 次实验基本代表了部实验的情况。

正交实验的设计, 主要工具是正交表。大多数生物统计学书都列出了可供选择的正交表,如L4 ( 23 ) , L8 (27 )见(表2 - 11 , 表2 - 12) 。字母L 右下角号码8 表示它有8 个实验要做, 括号内的指数7 表示这张表所安排的实验最多可考察7 个因素(也可安排2 个～6 个, 超过7 个要选择其他正交表) , 底数2 表示被考察b因素只要求两个水平。在进行实验前可根据要测试因素的多少及每种因素所考察的水平, 选择适合的正交表, 然后按表进行实验。现举一个例子来说明, 设影响某种植物试管苗生长的因素有光照时间、光照强度、pH 值、温度、蔗糖浓度、BA浓度、NAA 浓度7 个因素, 每个因素选择两个水平, 即, 光照时间( 10h , 14h )、光照强度(1000lx , 2000lx )、pH 值( 5 . 5 , 5 . 8 )、温度( 20℃ , 25℃) 、BA 浓度( 0 . 5 , 2 . 0 )、NAA 浓度( 0 . 5 ,1 . 0)、蔗糖浓度(2% , 4%)。现根据因素和水平的多少选择一个适合本实验的正交表, 选L8 (27)最理想, 填表时, 因素水平对号入座, 见表( 2 - 13 )。第一号实验是光照时间10h/ d、光照强度1000lx、pH 值5 . 5、BA 浓度2 . 0、NAA 浓度0 . 5、蔗糖浓度4% , 其他实验依次类推。根据8 个实验结果, 如出苗数量、苗高、生根数、移栽成活率等, 综合考虑, 根据需要选取各最适培养条件。也可通过一定的计算方法(参考统计学书) , 算出极差( R) , 极差(R) 表示每个因素在实验中所起作用的大小, R 越大表示该因素的不同水平对;验结果的影响越大, 但若没有可计算的指标时, 还是选择单因子实验较好。

2、初代培养物的建立

1）、保证无菌

2）、条件合适：首先, 一定要选择好合适的作物种类、品种及培养的部位; 其次,一定要选择合适的培养基, 激素及其他添加物; 还要注意掌握适宜的环境条件。所以在进行一种植物的组织培养之前, 应查找该种植物有关方面的资料, 根据这种植物过去所采用的培养部位、培养基、培养条件和培养技系, 再决定自己的工作步骤。

3）、操作技术过关

3、污染的防治

1）、植物材料的选择及防止污染

通常多年生的木本材料比一二年生的草本材料带菌多; 老的材料比幼嫩的材料带菌多; 田间生长的材料比温室生长的材料带菌多; 带泥土=材料比不带泥土的材料带菌多。为此对于培养材料的取材就应很认真地加以选择, 以减少污染的发生。

用茎尖作外植体时, 应在室内或无菌条件下对枝条进行预培养。将枝条用水冲洗干净后插入无糖的营养液或自来水中, 使其发枝, 然后以这种新抽的嫩枝条作为外植体, 便可大大减少材料的污染。或在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养, 待抽出徒长的黄化枝条时取材, 也可明显地减少污染。

对木本植物等难以消毒的材料可采用多次灭菌法。如将切好的外植体放入1 . 3%次氯酸盐溶液中(商品漂白粉25%的溶液)消毒30min , 然后用无菌水冲洗3 次, 再放在无菌条件下,次日用2 . 6%次氯酸钠灭菌30min , 然后用无菌水冲洗3 次。也可采用多种药液多次浸泡法,以加强灭菌效果。

材料内部易感染病菌, 在这种情况下, 必须在培养基中加入抗生素类, 防止初代培养物污染。

2）、人为污染的防止

接种前应用肥皂将手仔细洗净后, 再用70%酒精擦洗双手, 并需及时剪除指甲。在工作中特别要注意避免交叉感染, 双手必须清洁, 工具则用一次即需消毒一次。工作人员呼吸所产生的污染, 主要是接种时说话或咳嗽所引起的, 因此, 操作时严禁谈话, 并应戴上口罩, 也应穿工作服, 戴工作帽。

污染中特别注意一种呈乳白色的细菌污染, 这种细胞为芽孢杆菌。法国林木育种协会鉴定为迟缓芽孢杆菌( Bacillus lenlus) , 它外被荚膜, 耐高温, 一般消毒剂难以杀死。它可随培养材料、用具等传播; 它可出现在培养基表面, 或呈滴形云雾状存在于培养基内。若出现应严格灭菌, 清洗用具, 更换消毒酒精。

4、防止外植体褐变

1）、褐变的影响因素

褐变是由于组织中的多酚氧化酶被激活, 使细胞的代谢发生变化, 酚类物质被氧化后产生醌类物质, 这类物质呈棕褐色, 它们会逐渐扩散到培养基中, 抑制其他酶的⑿, 毒害培养的材料。褐变的影响因素是复杂的, 随植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同而危害的程度也有区别。

材料本身的生理状态不同, 接种后褐变的程度也不同。如在⒅蘩醯呐嘌中, 用幼年型的材料培养含醌类物质少, 而用成年型材料培养时含醌类物质多。而在卡德利亚兰的培养中, 较短的新生茎致褐物质含量高, 而较长的新生茎致褐物质含量低, 另外致褐物质的含量也因季节的不同而不同, 冬季褐变少, 夏秋季褐变最严重, 存活率最低。在枝条上取芽的时期及所取部位不同也有区别, 如欧洲栗取1 月后半月的芽培养则醌的形成少, 而在5 月～6 月取芽培养则醌类物质发生严重。在第一至第四个芽的生长期单宁类物质合成多, 因此, 接种后褐变也严重居妥赜糜啄弁庵蔡( 如胚)培养较少褐变, 而用高度分化的叶片接种后则容易褐变。总之, 分生部位接种后形成的醌类物质少, 而分化的部位则形成的醌类物质较多。

培养基成分过高的无狙闻ǘ然嵋起棕榈科植物外植体酚的氧化。例如油棕用MS无机盐培养基容易引起外植体的褐变, 而用降低了无机盐浓度的改良MS 培养基时则可减轻褐变, 而且可获得愈伤组织和胚状体。激素使用不当时, 材料也容易褐变。细胞分裂素6 - 苄基氨基嘌呤或激动素有刺激多酚氧化酶活性提高的作用, 这在甘蔗的组织培养中表现十分明显。在外植体最适宜的脱分化条件下, 分生能力强的细胞大量增殖, 酚类的氧化会受到抑制。在芽旺盛增殖时, 褐变也被抑制。此外, 培养条件不适宜, 如温度过高或光照过强, 均可使多酚氧化酶的活性提高, 从而加速被培养组织的褐变。

培养时间过长接种后材料培养时间过长, 未及时转移, 也会引起材料的褐变, 甚至导致全部死亡, 这在培养过程中是经常可见的。

2）、褐变的防止

选择适当的外植体和培养条件： 选择适当的外植体和培养条件是克服褐变的最主要的手段。外植体应有较强的分生能力, 在最适宜的细胞脱分化和再分化的培养条件下, 使外植体处于旺盛的生长状态, 便可大大减轻褐变。

抗氧化剂的作用：在培养基中加入抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮( PVP)、半胱氨酸等抗氧化剂, 或用抗氧化剂进行材料的预处理或预培养, 可减轻醌类物质的毒害。

连续转移：对于易褐变的材料, 进行连续转移, 可以减轻醌类物质对培养物的毒害作n。