当前位置 > >网站首页 >组培纵览 >传统组培
植物组织培养技术原理之灭菌方法
发布时间:2010-10-07

灭菌室



灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是:凡是暴露在空气中的物体,接触自然水源的物体,至少它的表面都是有菌的。依此观点,无菌室等未经处理的地方、超净台表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表,如整个消化道、呼吸道,即我们呼出的气体、培养器无论洗得多干净等等都是有菌的。

这里所指的菌,包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。茵的特点是:极小,肉眼看不见。无处不在,无时不有,无孔人。在自然条件下忍耐力强,生活条件要求简单,繁殖力极强,条件适宜时便可大量滋生。

无菌的范畴是:经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体,经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体(当然这些方法必须已经证明是有效的),高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部,强酸强碱,化学元素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的。从以上可以看出:在地球表面无菌世界要比有菌世界小得多。

灭菌是指用物理或化学的方法,杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体,即把所有生命的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒,它指杀死、消除或充分抑制部分微生物,使之不再发生危害作用,显然经过消毒,许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死,即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物,所以通过严格灭菌的操作空间(接种室、超净台、等)和使用的器皿,以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作,就叫傥蘧操作。

1、常用的灭菌方法: 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类,即:物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、偕波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施;化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。 湿热灭菌(培养基)  培养基在制备后的24h内完成灭菌傩颉8哐姑鹁的原理是:在密闭的蒸锅内,其中的蒸气不能外溢,压力不断上升,使水的沸点不断提高,从而锅内温度也随之增加。在o.1MPa的压力下,锅内温度达121℃。在此蒸气温度下,可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

注意完全排除锅内空气,使锅内全部是水蒸气,灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法,但目的都是要排净空气,使锅内均匀升温,保证灭菌彻底。常用方法是:关闭放气阀,通电后,待压力上升到O.05MPa时,打开放气阀,放出空气,待压力表指针归零后,再关闭放气阀。关阀再通电后,压力表上升达到0.1MPa时压力0.1-0.15MPa,20min。

对高压灭菌后不变质的物品,如无菌水、栽培介质、接种用具,可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间,既要保压彻底,又要防止培养基中的成分变质或效力降低,不能随意延长时间。

对于一些布制品,如实验服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好,高压灭菌20-30min。

高压灭菌前后的培养基,其pH值下降0.2-0.3单位。高压后培养基pH值的变化方向和幅度取决于多种因素。在高压灭菌前用碱调高pH值至预定值的则相反。培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时,高压灭菌后的pH值变化幅度较大,甚至可大于2个pH值单位。环境pH值的变化 于0.5单位就有可能产生明显的生理影响。

高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖,从而改变培养基的渗透压。在8%-20%蔗糖范围内,高压灭菌后的 养基约升高0.43倍。

培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解,可使15%-25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基值小于5.5,其水解量更多,培养基中 加0.1%活性炭时,高压下蔗糖水解大大增强,添加1%活性炭,蔗糖水解率可达5%。


2、防止高压灭菌培养基变化的方法:
(1)经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料,及时采取有效措施。
(2)设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇,以IBA代替IAA,控制活性炭的用量(在0.1%以下)注意pH值对高压灭菌下培养基中成分的影响等。
(3)配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙和铁放在最后加入。
(4)注意高压灭A后培养基pH值的变化及回复动态。如高压灭菌后的pH值常由5.80升高至6.48。而96h后又回降至5.8左右。这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握。


3、灼烧灭菌(用于无菌操作的器械)在无菌操作时,把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中,使用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧火菌。冷却后,立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶,放入95%的酒精,以便插入工具。


4、干热灭菌(玻璃器皿及耐热用具)干热灭菌是利用烘箱加热到160-180~C的温度来杀死微生物。由于在干热条件下,细菌的营养细胞的抗热性大为提高,接近芽抱的抗热水平,通常采用170℃持续90min来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥,工具等要妥为包扎,以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温,达到顶定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多,以免妨碍热对流和穿透,到指定时间断电后,待充分冷凉,才能打开烘箱,以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源消耗太大,浪费时间。

5、过滤灭菌(不耐热的物质 )一些生长调节剂,如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素圆荒腿鹊模不能用高压灭菌处理,通常采用过滤灭菌方法。
防细菌滤膜的网孔的直径为0.45μm以下,当溶液通过滤膜后,细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻,在需要过滤灭菌的液体量大时,常使用抽滤装置;液量小时,可用注射器。使用前对其高压灭菌,将滤膜装在注射器的靠针管处,将待过滤的液体装入注射器,推压注射器活塞杆,溶液压出滤膜,从针管压出的溶液就是无菌溶液。

6、紫外线和熏蒸灭菌(空间)

(1)紫外线灭菌  在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌,细菌吸收紫外线后,蛋白质和核酸发生结构变化,引起细菌的染色i变异,造成死亡。紫外线的波长为200―300nm,其中以260nm的杀菌能力最强,但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱,所以只适于空气和物体表面的灭菌,而且要求距照射物以不超过1.2m为宜。
(2)熏蒸灭菌  用加热焚烧、氧化等方法,使化学药剂变为气体状态扩散到空气中,以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便,只需要把消毒的空间关闭紧密即可。
常用熏蒸剂是甲醛,熏蒸时,房间关闭紧密,按5―8ml/m3用量,将甲醛置于广口容器中,加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时,房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸,但效果不如甲醛。

化学消毒剂的种类很多,它们使微生物的蛋白质变性,或竞争其酶系统,或降低其表面张力,增加菌体细胞浆膜的通透性,使细胞破裂或溶解。一般说来,温度越高,作用时间越长,杀菌效果越好。另外,由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用,所以要制成水溶状态,如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大,杀菌能力越强,但石蛩岷途凭例外。

7、喷雾灭菌(物体表面)物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等,可用70%的酒精反复涂擦灭菌,l%-2%的来苏儿溶液以及0.25%―1%的新洁尔灭也可以。

8、植物材料表面用消毒剂灭菌从外界或室内选取的植物材料,都不同程度地带有各种微生物。这些染源一旦带人培养基,便会造成培养基污染。因此,植物材料必须经严格的表面灭菌处理,再经无菌操作手续接到培养基上,这一过程叫做接种。


第一步,将采来的植物材料除去不用的部分,将需要的部分仔细洗干净,如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小,即灭菌容器能放人为宜。置自i水龙头下流水冲洗几分钟至数小时,冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料,可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。

洗时可加入洗衣粉清洗,然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物,除去脂质性的物质,便于灭菌液的直接接触。当然,最理想的清洗物质是表面活性物质―吐温。

第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成,准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸10~30s。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用,加之70%酒精穿透力强,也很易杀伤植物细胞,所以浸润<间不能过长。有一些特殊的材料,如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗,多层鳞片的休眠芽等等,以及主要取用内部的材料,则可只用70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下,待酒精蒸发后再剥除外层,取用内部材料。

第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多,可根据情况选取1―2种使用见表。上述灭菌剂应在使用前临时配制,氯化汞可短期内贮用。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌的,故灭菌时用广口瓶加盖较好;升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的;过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的,这种药剂残留的影响较小,灭菌后用无菌水涮洗3―4次即可;由于用升汞液灭菌的材料,难以对升汞残毒较难去除,所以应当用无菌水涮洗8~10次,每次不少于3min,以尽量去除残毒。

灭菌时,把沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中,记好时间,倒人消毒溶液,不时用玻璃棒轻轻搅动,以促进材料各部分与消毒溶液充分接触,驱除气泡,使消毒彻底。在快到时间之前1―2min,开始把消毒液倾人一备好的大烧杯内,要注意勿使材料倒出,倾净后立即倒入无菌水,轻搅涮洗。灭菌时间是从倒人消毒液开始,至倒入无菌水时为止。记录时间还便于比较消毒效果,以便改正。灭菌液要充分浸没材料,宁可多用些灭菌液,切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。

在灭菌溶液中加吐温―80或Tnton X效果较好,这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布,更容易浸人到烤的材料表面。但吐温加人后对材料的伤害也在增加,应注意吐温的用量和灭菌时间,一般加入灭菌液的O.5%,即在100ml加入15滴。

最后一步是用无菌水肯矗涮洗要每次3min左右,视采用的消毒液种类,涮洗3-l0次左右。无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。

点击排行

图说组培

组培文库

Copyright@ 2012,zupei.com All rights reserved. 济南普朗特生物科技有限公司版权所有 电话: 400-6968-123 组培设备及耗材专业制造商
服务信箱: webmaster@zupei.com 传真:0531-82373396 “鲁ICP备05017979号”