在材料增殖到一定数量后，就要使部分培养物分流，从而进入壮苗与生根途径。若不能将培养物大量转移到生根培养基上，就会使久不转移的苗子发黄老化，或因过分拥挤而致使无效苗增多，最后被迫淘汰许多材料。
在生根壮苗培养基上，成丛的苗要被分离成单苗，使其迅速生根，让苗长高便于以后移栽。多数植物生根阶段只需一次培养。一般认为矿物元素浓度较高时有利于发展茎叶，较低时有利于生根，所多采用1/2或1/4量的MS培养基，全部去掉或仅用很低的细胞分裂素，并加入适量的生长素，用得最普遍的是NAA，随植物种类不同，一般2－4d即可见根，当洁白的正常短根长到1cm左右时即可出瓶种植。
少数植物生根比较困难，需要采用粗试管加液体培养基，并在试管中放置滤纸做的筒状杯（叫滤纸桥），托住切成单条的嫩枝。滤纸桥略高于液面，靠滤纸的吸水性供应嫩枝的水、营养成分和生长素等，可使生根过程加速，这类植物如山茶花等木本花卉。
容易生根的植物，采用下述方式之一，即可形成完整的再生植株。
（1）延长在增殖培养基中的培养时间就能长出根来，如洒金柳等。
（2）有意降低一些增殖率，减少细胞分裂素的用量而增加生长素的用量，将增殖与生根合并为一步，这种方法在吊兰、花叶芋、火炬花等能丛植的植物种类中效果显著。
（3）切割粗壮的嫩枝在适宜的介质（培养瓶外）中生根，如桤木嗄承┒啪椤⒕栈ā⑾闶竹等。
在比较少的情况下，因植物种类或培养基不适合，尤其是增殖阶段细胞分裂素用量过高时，易引起生根困难。若在小苗时残留的细胞分裂素数量较多，在生根培养基上仍不能停止增殖，可在无激素的MS培养基中过渡培养一次，才转接到生根培养基中。嘈┥长细弱的植物需要增加一次培养壮苗的步骤，使苗粗壮，便于诱导生根和以后的种植。通常采用不加激素的培养基即可。
从胚状体发育成的小苗，常带有原先即已分化的根，可以不经诱导生根阶段，但因经胚状体途径发育的苗数特别多，且个体较小，所以也需要一个低的或没嘀参锛に氐呐嘌基培养的阶段，以便壮苗生根。
试管内生根和壮苗阶段的目的，是为了成功的将组培苗移植到试管外的环境中，也是使试管苗适应外部环境的一个过渡时期。试管中的植物是以培养基中的糖为碳源，即异养型，生根壮苗阶段必须进行调整，使它们减少对异养条件的嗬担逐步增强光合作用的能力。办法是同时采取两项措施，即减少培养基中糖含量和提高光照强度。糖约减少一半，光强随植物种类不同而异，由原来的300～500lx或500～1000lx的水平提高到1000～30001x或5000lx的水平。在无机盐和糖浓度减半、高光强的条件下，植物能较好地生根，对水分胁迫和疾病的抗性也会有所增强，植株可能表现出生长延缓和较轻微的失绿，但事实证明，这样的幼苗，要比在低光强条件下的较绿较高的幼苗移栽成活率更高。自然光照的较灯光照明的组培苗更能适应室外环境。