愈伤组织的形成大致经过起始期、分裂期和形成期。实际上三个时期的界限并不十分严格，只是便于人们了解愈伤组织生长时的相对状况。
起始期是指细胞准备进行分裂的时期，当外植体已分化的活细胞在外源植物生长物质的作用下，通过脱分化起动而进入分裂和形成愈伤组织。这个时期的细胞大小虽无明显变化，但细胞内RNA含量迅速明显增加，细胞核也变大。诱导细胞活化的过程是一个重新恢复分裂能力的过程。有人认为，损伤是引起诱导细胞分裂的一个重要因素，受伤细胞释放出来的物质和2，4－D共同诱导细胞发生分裂，是诱导愈伤组织形成的主要原因。
分裂期的特征表现为外层细胞出现分裂，使得外层细胞变小并逐渐回复到分生组织状态，在这个过程中细胞分裂进入最旺盛时期，细胞体积最小，细胞核和核仁较大，RNA含量最高。细胞的脱分化就是指细胞由静止状态进入分裂时期，恢复分裂机能的这一状态。外植体组织经过不断生长和细胞分裂，形成愈伤组织并开始转入分化新的结构。
进入形成期的特征是细胞大小趋于稳定，细胞分裂从分裂期的周缘细胞分裂为主转向了内部的组织，随着愈伤组织表层细胞分裂的减缓和停止，内部深处的细胞开始分裂并形成象维管束或类似分生组织组成的鸟巢状结构。
不同植物来源的愈伤组织，在质地、形态和物理性状方面均有明显的差异。有的愈伤组织呈淡黄色或白色，有的呈绿色或红色。如华猕猴桃的茎段经离体培养产生的愈伤组织为淡绿色，致密而呈瘤状，但在2,4-D的诱导作用下，愈伤组织则呈黄白色，发脆且易于分散。一般说来，来源于相同组织的愈伤组织，其色素大致相同，但通过反复继代培养会失去色素。
同一植株不同器官形成愈伤组织的能力不同，以君子兰为例，用MS＋2mg・L－16-BA＋2 mg・L－1NAA＋1 mg・L－12，4-D固体培养基培养，茎尖、茎切块和叶片形成愈伤组织的诱导率分别为85％，13％和72％；如果培养基中6－BA的浓度提高到5mg・L－1，NAA的浓度减少至0.5 mg・L－1，2，4-D浓度不变时，茎尖、茎切块和叶片形成愈伤组织的诱导率分别为82％、9％和70％，说明培养基中植物生长物质组成的比例不同，影响着愈伤组织的形成。
选择适当的基本培养基对愈伤组织的生长也是重要的。于树宏和李玲（1999）用浅绿色野葛叶片愈伤组织进行继代培养，在MS培养基中加入1 mg・L－1NAA，愈伤组织能维持槁躺新鲜健壮的外观；在培养基中同时加入3 mg・L－16-BA和1 mg・L－1NAA，愈伤组织快速生长；但愈伤组织置于含有同样浓度的6-BA和NAA的B5培养基上生长，愈伤组织可以始终保持新鲜健壮的外观，不断膨大生长。