第1节 单细胞培养技术
1 单细胞的分离
细胞来源:完整的植物器官、培养的组织通过物理的或酶处理的方法获得, 常用分散性较好的愈伤组织或悬浮培养物进行制备.
1.1 愈伤组织培养
选择外植体® 表面消毒® 接种® 培养® 继代培养® 筛选疏松愈伤组织
1.2 单细胞的分离方法：
1）物理方法：
多次继代培养得到的疏松愈伤组织转入液体培养基:
a 采用合适方法震荡使细胞分散;
b 向细胞悬液中吹脉冲压缩空气； 过滤
c 在显微镜下用吸管吸取等。
2）化学方法：
加秋水仙碱；加草酸盐等；加2,4-D、CH等对分散细胞也有利。
3）酶处理：
a)果胶酶；b)纤维素酶；c)葡萄糖苷酶和半乳糖苷酶等。
2 单细胞培养技术
2.1平板培养
将一定量的细胞接种到或混合到装有一薄层固体培养基的培养皿内s行培养的技术。
每个平板上新形成的细胞团数
植板率= ――――――――――――――′100%
每个平板上接种的细胞数
注意事项:
最低起始细胞密度
在保证获得高的植板率的前提下,尽量使接种细胞的起始密度降低（条件培养基；有机a分）.
选用处于旺盛分裂期的细胞.
尽量减少细胞损伤. 在单细胞悬液和融化的琼脂培养基混合时,温度不应超过350 C.
最好置于黑暗或弱光下进行培养
2.2 条件培养
条件培养基：
已经进行过一段时间细胞悬浮培养的培养基。
制作方法:
配制悬浮细胞培养基®接种愈伤组织或悬浮细胞®培养®离心®上清液
固体条件培养基：上清液与加琼脂的灭菌培养基趁热充分混合.
2.3 看护培养和饲喂层技术
在活跃生长的愈伤组织上培养单细胞,并使之生长和增殖的p法叫看护培养。
用处理过的无活性的或分裂很慢、不具备分裂代谢能力的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长的方法叫饲喂层培养。
2.4 微室培养：是为了进行单细胞活体连续观察而建立的一种微量细胞培养技术。
微室技术要点：
(1) 对微室的要求:
制作材料的光学性能要非常好；
小<的厚度要符合相差显微镜的要求;
选择合适的材料使小室与外界隔绝,应既能防止污染，又保证小室与外界能进行适当的气体交换.
(2) 对培养基的要求:
选用的培养基要保证微室中的细胞能够生长和分裂,并应有较高的光学透明度.
(3) 对所观察的细胞的要求:
选用生长旺盛,处于活跃分裂期并易于分散的细胞;细胞壁要较薄,细胞内含物要较少和透明度较高.
2.5 其他技术
液体浅层培养
将欲培养的分散细胞直接接入盛有浅p液体培养基的培养皿中进行培养。
微滴培养技术等：详见“原生质体培养”
第2节 植物细胞悬浮培养技术
将植物细胞和小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养的技术。细t在培养过程中能保持较好的分散状态.
(1)增加了细胞与培养液的接触面,改善了营养供应;
(2)可避免有害代谢物在局部浓度过高;
(3)有利氧的充分供应.
1 基本过程――以水稻细胞悬浮培养为例
1.1 愈伤组织培养
合适外植体
↓消毒，25oC左右暗培养
愈伤组织
↓约2周
继代培养
↓
筛选疏松愈伤组织
1.2 单细胞的分离
愈伤组织细胞计数
↓
单细胞的机械分离
↓
悬浮液的过滤
↓
单细胞的收集
↓
制成细胞悬液
1.3 单细胞悬浮培养
悬液细胞计数
↓
s细胞率测定
↓
悬浮培养
↓
细胞团和愈伤组织再形成
↓
转至分化培养基
↓
植株再生
2 培养工艺
2.1 分批培养
2.2 连续培养
（1）封闭式连续培养
新鲜培养液的注入和旧培养物的排出是平衡的。排出液中的细胞收集后仍加回培养系统中。
（2）开放式连续培养
新鲜培养基的加入和等体积的培养物的收获是平衡的. 这种平衡一般调节在使培养物能保持衡稳的、亚最大生长速率水平.
a 恒化培养 (化学恒定培养法 )
b 恒浊培养 (浊度恒定培养法 )
第 3节 植物细胞的大规模培养和次生物质生产
研究概况：
1949年Caplin and Steward提出, 高等植物细胞具有合成天然产物的潜力.(细胞全能性概念的发展)
1956年,Routin and Nickell首次申报了利用植物细胞培养技术生产天然产物的专利.
已有多种植物细胞培养物进入中试阶段和实现了工业化生产
附表：利用细胞培养所得的部分物质类别；部分细胞培养产物含量超过植物体产量的实例
优越性
利用植物细胞培养技术可以生产多种有较高经济和实用价值的次级代谢产物；
有望利用该技术进行这些次级代谢物的大规模工业化生产；快速、高效
占地少，不受病虫害、地理、气候、季节等影响；
有利于环境和珍稀植物资源保护；… …
存在问题：
(1) 细胞生长和产物的生物合成的速度不够理想；
(2) 细胞株可能会发生退化或变异；
(3) 植物细胞对剪切力敏感；
(4) 生产成本过高；
… ...
利用植物细胞大规模培养生产次生物质的 一般工艺流程:
外植体
L K
愈伤组织 悬浮细胞系
K L
单细胞培养
↓
筛选高产细胞系和培养条件
↓
生物反应器中大量培养细胞
↓
合适时期收获培养物
↓
分离纯化
↓
产物
1 细胞株的选择
一般原则: 细胞生长速度快;目的产物含量高.
高产细胞系一般根据单细胞克隆的次生代谢产物含量筛选。
一般过程:
从健壮植株的合适部位取材
→愈伤组织培养
→液体培养基中震荡以打散细胞
→单细胞培养
→分离出生长茁壮的细胞群落
→以特定目的产物的含量选择细胞株
合成色素的细胞系一般可根据细胞表型进行筛选.
2 培养基的选择
(1) 一般原则: 能使被培养的细胞或组织达到所希望的生长速度；且应有利于目的产物的生产。
细胞总体的倍增时间一般为1d左右即可.
常需分别设计适合细胞生长和目的产物合成的培养基，在不同阶段予以调整。
(2) 植物生长物质： 不同种类和不同浓度可能有不同影响.
(3) 前体： 类别;用量; 时间；费用;……
(4) 诱导子(激发子)： 生物诱导子;非生物诱导子
3 培养条件的选择
（1） 光 光照时间的长短、光质和光强对不少次级产物的生产都有影响.
（2） 温度 不同细胞培养物的最适生长温度不同;不同次生代谢物的合成和积累,在不同温度下也有差异.
（3） pH 一般在pH为5~6之间进行； pH稳定往往对生产有利
4 生物反应器的选择
1) 摇瓶 进行植物细胞悬浮培养的第一步通常都是采用摇瓶。
2) 机械搅拌式反应器 这类反应器采用的形状、大小等各不相同, 但总的原理都是利用机械搅动使细胞得以悬浮和通气.
优点：供氧和混合效果好；可借鉴微生物培养的经验。
缺点：剪切力大，易对细胞造成损伤；易污染等。
3）气升式反应器(空气升液式反应器；air-lift bioreactor)
优点:剪切力小, 混合好,并且可以避免叶轮转动轴的封口处被污染.
缺点：细胞浓度高时┖闲Ч较差等。
4) 固定化细胞生物反应系统 细胞的固定化培养是将生活细胞或原生质体固定于高分子化合物中进行培养┘际.
应用最广的是将细胞包埋于海藻酸盐或卡拉胶中,然后再进行液体震荡培养的方法.
包埋剂：
(1） 海藻酸（alginate;褐藻酸;海藻酸盐）：由葡萄糖醛酸和甘露糖醛酸组成的多糖.在钙和其它多价阳离子存在时,就能形成凝胶;当加入钙离子络合剂时,这种凝胶就能溶解.
海藻酸盐的类型不同,用于固定化的浓度也应进行调整.
(2） 卡拉胶(carrageenan，角叉藻聚糖)：在钾离子存在条件下, 能形成较硬凝胶的聚磺酸多糖 (polysulfonated polysaccharide).不同卡拉胶呈液态的温度不同。
(3） 琼脂糖等
Alginate固定化的一般实验室操作
用液体培养基配制2~5%的海藻酸钠溶液
ˉˉ
灭菌(1210C；一般灭菌时间不应超过20min）
ˉˉ
混合植物细胞(2g)和海藻酸钠溶液(8g）
ˉˉ
将混合悬液装入10ml塑料注射器中, 慢慢滴入盛有50mmol/L CaCl2的三角瓶中,不断轻轻搅拌,以便形成球形颗粒
ˉˉ
形成的颗粒在溶液中保持30min
ˉˉ
过滤收集颗粒
ˉˉ
用含有50mmol/L氯化钙的培养基清洗
ˉˉ
转入装有(8ml)培养基的摇瓶中培养.
固定化生物反应器:
流化床;填充床等
中空纤维反应器
中空纤维：用聚砜、聚丙烯、醋酸纤维素等制成。管壁似海绵状，富含毛细管。
5) 其它生物反应器
雾化生物反应器
光照生物反应器
5 产物的分离纯化
5.1 -胞破碎 不同组织、细胞，破碎方法和条件不同
（1） 机械破碎法（捣碎、研磨、匀浆法等）
（2） 物理破-法（温度差、压力差、超声波等）
（3） 化学破碎法（有机溶剂、表面活性剂等）
（4） 酶促破碎法 （利用自身-系或外加酶系的催化作用）
5.2 产物的提取
在一定条件下，用适当的溶剂处理原料，使所需的代谢物充分溶解到溶剂中的过程。又称抽提。
5.3 产物的分离
1）沉淀分离
通过改变某些条件或添加某些物质，使次级代谢产物在溶液中的溶解度降低，从溶液中沉淀析出，从而与其他杂质分离的技术。
1）金属盐沉淀法；
（2）PH值沉淀法/等电点沉淀法
（3）有机溶剂沉淀法
（4）盐析沉淀法
（5）复合沉淀法 等
2） 层析分离
利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。
（1）吸附层析
（2）分配层析（纸层析、薄层层析等）
（3）离子交换层析
（4）凝胶层析
3）萃取分离
利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。
4） 结晶
溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。
（1）盐析结晶法
（2）有机溶剂结晶法
（3）透析平衡结晶法
（4）等电点结晶法
（5）成盐结晶法
（6）降温结晶
5.4 浓缩与干燥
溶质与溶剂(经常是水)分离的过程.
1） 浓缩
从低浓度溶液中除去部分水或其他溶剂而成为高浓度溶液的过程.
蒸发浓缩：通过加热或减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。
2）干燥
将固体、半固体或浓缩液中的水或其他溶剂除去一部分，以获得含水较少的固体物质的过程。
真空干燥 ；冷冻干燥；喷雾干燥；
气流干燥；吸附干燥
6 操作实例：伊贝母细胞培养及其生物碱含量测定：
1) 疏松愈伤组织诱导
成熟胚→MS固体培养基+2,4-D1~2mg/L +KT0.2~0.5mg/L +GA2~6mg/L → 25oC暗培养→愈伤组织
2) 细胞悬浮培养
疏松愈伤组织→1/2MS液体培养基+2,4-D0.1~0.5mg/L +KT0.02~0.05mg/L →100r/min往复式摇床培养――――→细胞增重8.3~10.8倍
25oC，20d
3)发酵罐培养
2L小型搅拌式发酵罐，加入液体培养基1.5L（1/2 MS +2,4-D0.2mg/L+KT0.04mg/L +NAA0.2mg/L），接种悬浮培养细胞（1.5g/L）, 28oC,通气量0.4L/min,搅拌速度100r/min。培养18d，获得细胞干重29.6g.
4）生物碱含量测定
西贝素含量（0.038%）高于栽培贝母鳞茎中的(0.014%) 1倍以上。
