摘要

综述我国牡丹组织培养研究现状及进展,着重介绍以种子、茎、芽、幼叶、叶柄、根等作为外植体进行培养的研究成果。牡丹组培养的技术已经逐渐趋于完善,但对于大规模生产还存在困难,主要在组培品种少,培养物褐化、玻璃化、生根难以及培养基的筛选、合适的外植体等问题需要进一步研究。

牡丹(Paeonia suffruticosa Andr)

别名富贵花、百两金、木芍药、鼠姑、鹿韭,为芍药科芍药属植物,牡丹传统的繁殖方法有性繁殖中的种子繁殖,无性繁殖中的分株、压条、嫁接繁殖等。这些繁殖方法受着各种因素的影响,由于多种牡丹结实率低甚至不结实，且种子发育不良，用种子繁殖难以获得优良植株，无性繁殖受生长季节的限制、繁殖系数小、形不成规模，无法满足市场的需求，而利用组培技术繁殖牡丹周期短，繁殖系数高，便于大规模生产，因此,牡丹品种群的组培技术已经成为主要研究方向。笔者通过对20年来牡丹组培技术的综述，为牡丹种苗快速繁殖生产技术的现代化提供科学理论依据,并为以后的研究提供有价值的参考。

1 种子培养

在已经报道的牡丹种子组织培养中,主要以种胚作为外植体,培养基以MS为基本培养基,添加不同浓度的激素。胚培养技术可以用来克服胚败育和发育不良,同时也可以缩短种子休眠期,提高萌发率和提早萌发。黄守印对牡丹进行胚培养,将牡丹胚分别接种在2种培养基上，即A:MS+BA0.5mg/L+IAA1mg/L+蔗糖3%;B:MS+BA0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+LH100mg/L+蔗糖2%。在A上培养10 d后,体积增大,2片子叶张开,从叶缘开始变绿,30 d左右新叶长出;在B上培养60 d,始终未见任何变化。将A上长出的小苗转移到MS+BA1mg/L+NAA0~0.01mg/L+蔗糖2%~3%的培养基上,可促使产生较多腋芽,切割后可在同样培养基上继代,便形成丛生芽。周仁超用紫斑牡丹(PaeoniarockiiT.Hong etLiJ.J.)为材料研究胚培养和植株再生,种胚在1/2MS+BA1mg/L+IAA1.0mg/L的培养基上可以较快生长并分化出不定芽,不定芽在1/2MS+BA1mg/L+IAA0.2 mg/L培养嗌峡煽焖俜敝,平均增殖倍数达6.5。曹小勇以濒危紫斑牡丹的胚进行组培,在没有添加任何激素的培养基上,离体胚生长类似种子萌发时胚的生长模式,子叶扩大伸长,约到达种子大小时停顿,根伸长生长极其显著,进一步得出:BA促进子叶膨大生长,当BA浓度增大时根生长受到抑制;NAA促进愈伤嘀形成,抑制根生长,0.1mg/LBA促进紫斑牡丹胚的胚轴、根生长，有利于幼苗形成。张子学等分别采用凤丹(Paeonia ostii)的种子、种胚以及由此产生的子叶、叶柄、叶片和愈伤组织等作为外植体进行芽的诱导,结果采用胚培养可以打破上胚轴的休眠,大大缩短初代培养周期,进一步得:凤丹种胚初代培养的适宜培养基MS+BA0.25mg/L+NAA0.05mg/L+BR0.00001mg/L,适宜的芽增殖培养基MS+BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+TDZ0.001mg/L,适宜的生根培养基1/2MS+IBA0.8~1.2mg/L。

2 茎尖培养

目前,牡丹茎尖培养主要是针对芽的茎尖,并且取得了进展。李玉龙等运用“青龙卧墨池”和“杂种18号”的腋芽茎尖进行培养,在培养基1/2MS+BA0.5~1.0mg/L+GA30.1~0.5mg/L+KT0.2~1.0mg/L得到愈伤组织,在培养基MS+BA0.2~2.0mg/L+GA30.2~0.5mg/L使芽伸长,在培养基1/2MS+IBA/IAA0.1~2.0mg/L+2%

蔗糖+0.5%活性炭诱导生根。谢静萱运用牡丹(枯枝牡丹)的腋芽茎尖,+培养基MS+BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+LH500mg/L+蔗糖5%获得愈伤组织及分化出芽。张龙勃等运用“胡红”的休眠芽茎尖,在培养基MS+BA1.5mg/L+KT0.5mg/L获得幼苗。孔祥生等运用“姚黄”、“洛阳红”的休眠芽茎尖,在培养基1/2MS(大量减半)+BA1.0mg/L+GA30.5mg/L获得愈伤组织、丛生芽。

3 芽培养

目前,已报道的牡丹芽培养中,多 以鳞芽为外植体进行研究,包括腋芽、花芽、顶芽、休眠芽等,在所有鳞芽中,以休眠芽的分化表现最好,分化率可达94%,花芽最差仅16%。不同取材时期对芽培养也有影响,12月至翌年2月取材,经过低温休眠,芽充分分化,营养物质累积丰富,苞片紧密,污染率低,成活率高,萌发时间早,因此,此时 取材最好。张桂花等在牡丹芽萌发期和休眠期分别进行腋芽和顶芽组织培养,结果表明:自芽萌动至开始休眠为适宜培养期,芽诱导最佳培养基为MS+6-BA0.5~1mg/L+NAA0.1~0.2mg/L,MS为最佳壮苗培养基,牡丹试管苗培养的适宜光照强度为2000 lx,光照时数为10 h/d,适宜温度(25±1)℃。刘淑敏运用“古班同春的花芽,在培养基MS+VC+BA获得幼苗。陈怡平等以紫斑牡丹休眠地下芽为材料,对同一时间打破休眠的地下芽在3种不同培养基上的发育状况、不同时期低温处理后在同一培养基上的发育以及不同时期休眠地下芽在同一培养条件下的发育进行了比较研究,得出MS+BA1mg/L+NAA0.5mg/L+2,4-D0.5mg/L最有于打破休眠的地下芽发育,720 h的低温处理对于地下芽的萌发率及发育速率最,彻底打破休眠的不同时期地下芽在同一培养条件下发育速率基本一致。陈笑蕾采用“洛阳红”、“胡红”、“肉芙蓉”、“鲁荷红”、“乌龙捧盛”和“朱砂垒”牡丹种的鳞芽诱导培养,结果表明:品种之间的增殖率、综合萌芽率和增殖系数,“乌龙捧盛”品种表现较好。以“乌龙捧盛”鳞芽为材料,对鳞芽增殖系数的影响依次为:NAA>基本培养基类型>6-BA>IAA;培养基MS+Ca2+(WPM)+6-BA 2.0mg/L+IAA0.3mg/L和MS+Ca2++6-BA1.0mg/L+IAA0.1mg/L有利于试管苗的增殖,继代培养时间应低于35 d。在生根培养过程中,IBA和基本培养基类型是影响牡丹试管苗生根率的主要因素,培养基1/2MS+IBA 1.0 mg/L+IAA 1.0mg/L+蔗糖20mg/L有利于根的诱导;基本培n基类型和蔗糖浓度是影响牡丹试管苗平均根生长的重要因素,培养基wPM+IBA1.0mg/L+IAA1.0mg/L+蔗糖40mg/L有利于根的生长;IAA浓度和蔗糖浓度是影响牡丹试管苗根数的重要因素,培养基1/4MS+IBA3.0mg/L+IAA3.0mg/L+蔗糖30mg/L 和培养基1/2MS+Ca2+WPM)+IAA3.0mg/L。

4叶及叶柄培养

为保存牡丹种质资源,加速珍稀品种的扩大繁殖,以及增添培育新品种,研究组织培养方法是其必要的。中外学者已利用牡丹的某些品种进行了研究,积累了较为丰富的资料,对于用叶及叶柄进行中国牡丹组织培养取得了一些进展。李丽霞等以牡丹“荷花紫”、“h胡红”品种的幼叶作外植体,采用正交设计法,考察6-BA、2,4-D、KT、NAA 4种激素及酪蛋白对牡丹愈伤组织产生的影响,确定适宜的激素种类及水平,优化筛选出适宜于两个牡丹品种的愈伤组织诱导培养基,得出:激素2,4-D是幼叶愈伤诱导的关键因素,适宜于牡丹“荷花紫”及“大胡红”初培养的培养基配方均为1/2MS+2,4-D4mg/L+KT0.2mg/L+NAA0.4mg/L+酪蛋白200mg/L。何松林等以“洛阳红”叶柄为试验材料,探讨离体培养中褐化的防止,得出:WPM为基本培养基时褐化现象最轻,1/2MS次之,MS褐化现象最为严重;3种抗氧化剂和吸附剂对褐化的抑制作用较明显,其中以PVP最好,VC较次之,Na2S2O3最差;外植体采取前对母株进行遮光处理以及在培养过程中对材料进行暗处理有利于抑制褐化;培养基中生长调节物质(BA、NAA)的浓度变化对褐化没有明显的影响陈怡平等先后分别用紫斑牡丹的土芽、叶柄、叶片、幼芽、心皮、雄蕊及经一段时间组织培养的试管苗等作外植体进行愈伤组织的诱导,得出:配方MS+BA15 mg/L+NAA2 mg/L最为理想;不同外植体中,试管苗的幼芽和土芽诱导率最高,叶柄和叶片次之,其诱导率分别为100%、60%、30.8%,而生殖器官雄蕊和心皮未能诱导成功。

5 根培养

牡丹为芍药科木本植物,分观赏和药用两类。药用牡丹的有效部分是根皮,俗称丹皮。丹皮是中医临床上的常用药材,主要的药用成分是丹皮酚,它具有抗菌、降压、抗血栓和抗动脉硬化等作用,主治热病吐血、血瘀、经痛、跌打瘀血作痛、高血压和中风。时侠清等采用植物组培的方法,用牡丹品种凤丹根韧皮部为材料诱导愈伤组织,得出:在MS培养基中加入1.0mg/L2,4-D或1.5mg/LNAA,愈伤组织的诱导率大于70%;培养基中加入1.0 mg/L 2,4-D和5.0 ng/LTDZ或1.5mg/LNAA和5.0 ng/LTDZ,并在29℃、黑暗条件下继代培养,可以显著提高牡丹根皮愈伤组织的增长倍数和丹皮酚含量。

6 洛阳牡丹组培进展

作为植物繁殖的新手段,组织培养技术已日益普及,这种在无菌条件下进行的无g繁殖和常规方法相比,最显著的优点是可以用较短的时间和较少的空间,且不受季节、气候的影响,由个体开始,产生大量的植株。为加速牡丹产业化的发展,

中国洛阳国家牡丹园于2004年6月开 始投入运行牡丹植株组培工作。该项研究主要分为4个阶段进行。第一个阶段是培养物的建立,即选择适合的外植株。为了保证培养物的无菌性,对外植体的消毒方法、时间都需要一个摸底过程,找出一个最佳的方法。第二个阶段是茎芽的增殖方法。通过诱导不定芽,实现增殖和增强腋芽生枝能力的方法。第三个阶段是离体植株的生根。在有细胞分裂素存在的情况下,由不定芽和腋芽长成的枝条一般都没有根,为了得到完整植株,必须把其转入生根培养基中。第四阶段是生根苗的移栽。把植株由试管移栽入土,须十分小心地分步进行。牡丹试管苗的生根和移栽是一项非常艰巨的工作,也是影响牡丹微繁的关键。对于牡丹组织培养技术,关系到培养基、激素以及外植体的选择,牡丹属于木本植物,由于其多年田间生长,通过组织培养建立繁殖体系相对困难,并且木本植物组织培养的培养基成分对同一树种可能因基因型不同而不同、因继代培养不同而不同,在培养过程中培养物褐化、玻璃化问题较目朔。目前,

对于牡丹的组培仅限于几个药用品种,而对于观赏品种还比较少,且品种区间太小,面对生根难等问题,需要将牡丹与基因技术及木本植物组培方法结合起来,不仅要解决牡丹组培中各种问题,而且要将组培品种的范围扩展到各个观赏品种与

药用品种,要从外植体、培养基、培养条件等防止褐变与玻璃 化的发生。目前,正在对江南牡丹品种进行种胚培养,已经开始继代培养基的选择,下一步将对继代培养基中的苗子在一特制的大玻璃瓶中进行木质化培养,最后对其进行嫁接繁殖,从而间接地克服牡丹组织培养生根难的问题,为牡丹产业化发展及新品种选育等奠定基础。