一 实验目的：

1 掌握植物细胞组织培养的原理和方法；     2了解植物组织培养的方法； 3 学习植物组织培养的原>；     4 了解不同浓度BA对蝴蝶兰生根的影响；    5了解炼苗的作用；    6掌握训化的方法步骤；     7观察蝴蝶兰组织培养到种植的全过程，并注意其中出现的问题。

二 实验原桑

蝴蝶兰为兰科蝴蝶兰属植物,因花型奇特、色彩艳丽、花期长久而享有“洋兰皇后”的美誉。蝴蝶兰原产于缅甸、菲律宾、台湾、马来西亚、印度尼西亚等热带亚洲地区,具有极高的观赏和经济价值,是国际上最具商业价值的四大观赏热带兰之一。蝴蝶兰属单茎性气生兰,再生能力弱,很难进行分株繁殖,且种子无胚乳,自然条件下难以萌发,增殖系数低,难以满足日益增长的市场需求。应用植物组织培养技术进行蝴蝶兰快速繁殖可以缩短繁育周期,获得大量成株,并可以保持优良性状,维护种质资源,是蝴蝶兰快速繁殖的笮途径。在以蝴蝶兰根尖、茎尖、叶片和花梗芽为外植体诱导原球茎时,由于根尖的诱导率低,摘取茎尖会损失母株等原因,因此在蝴蝶兰组织培养中根和茎都不是诱导原球茎的理想材料。而蝴蝶兰叶片和花梗芽作为外植体诱导圆球茎时,其诱导率较高、对母株伤害不大,是较为理想的外植体材料。

三  材料与用具：

蝴蝶兰的茎尖、1/ 2MS +BA2. 5 mg/L + NAA0. 2 mg/L花梗腋芽诱导培养基、1/ 2 MS + BA3. 5 mg/L + KT1. 0 mg/L + NAA0. 5 mg/L + 椰乳10 %增殖培养基、母液、量筒、烧杯、玻璃棒、移液管、无菌水、高压灭菌器、容量瓶、pH试纸、75%酒精、2%次氯酸钠、镊子、解剖刀、超净工作台、95%酒精、穴盘等。

四  方法与步骤

（1）母液的配制  根据需要的母液量配制母液，配好后要贴好标签，以防弄错。标签上要注明是什么母液和母液的稀释倍数。将配好的母液进行储藏，要用的时候可以方便使用。

配制培养液时应注意：

①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；

②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；

（2）培养基的配制

①花梗腋芽诱导培养基为1/ 2MS +BA2. 5 mg/L + NAA0. 2 mg/L 。

②增殖培养基为1/ 2 MS + BA3. 5 mg/L + KT1. 0 mg/L + NAA0. 5 mg/L + 椰乳10 %。

③生根培养基为1/ 2MS + BA1. 5 mg/L +NAA0. 3 mg/L + 80 g/L 香蕉泥以上培养基p H 均为5. 5

注意事项：

1、配制培养基时要注意母液的倍数，浓度；计算时要仔细不要看错。

2、量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。

3、在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的久了，就需要重新称量、制备。

4、调pH 用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液或1 mol/L的稀盐酸，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.4～7.0)测培养基的pH，一直到培养基的pH为5.5为止。

5、培养基的分装 溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将H养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入培养瓶中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上，培养基分装完毕后，应及时封盖瓶口。

6、在高压灭菌时，要正确使用高压灭菌器。加水时水要没过电热丝，在第一次到108度时要进行放气，让锅里的冷空气放出。之后要将温度保持在121度，时间为20分钟。20分钟后要等到指针为0时，才能打开锅盖。

（3）材料消毒与接种

1、切下其带芽茎段,长约2 - 3cm ,用自来水清洗干净,再在75%酒精中浸泡40秒；然后用无菌水清洗一次；再在2%次氯酸钠中浸泡15 分钟，浸泡时不断搅动；再用无菌水清洗两次。

2、在整理清洗材料的同时对超净工作台进行消毒，消毒时间为20分钟。

3、消毒完成后，将茎段置于超净工作台上,先用75 %的酒精消毒30 s ,无菌水清洗2 次。

4、经无菌水冲洗数次,将带芽茎段接种到经设计的不同激素组合的诱导培养基上。

（4）生根壮苗
接种在1/ 2MS +BA2. 5 mg/L + NAA0. 2 mg/L培养基上的外植体在培养 20 d后开始初步形成原球茎，此时进行第1次转接。接下来较长时间(约40 d)内，原球茎进一步发育完全，此过程也需转接2次。从茎尖培养开始至60 d后观察发现，污染率为零，外植体成活率高达90．9 ，原球茎的诱导率为87．6 ．培养60 d，转接3次后，将初代培养中未形成原球茎的植株去掉，将诱导生成的生长较快的原球茎分割成小幼橹块。小的组织块经过1～2个月培养后又形成原球茎，将其接种在相同的N 培养基上进行继代培养。如此反复切割增殖，实现了原球茎的增殖。此过程需约30 d的时间，其间需要3次转接。实验观察发现，原球茎的再生能力很强，经过切割后的原球茎在新的培养基上实现了增殖，不但每个外植体平均分化出3．4个植株，并且形成3．4个原球茎，原球茎的形成率达到100 。

生根壮苗阶段关键在于严格筛选激素的种类和浓度, 一般需降低培养基的激素含量, 以便形成健壮苗。常用的生长素有IBA(0.3~1.5mg/L)、NAA(0.1~0.8mg/L)。添加GA3 0.1mg/L + NAA 0.1mg/L 的组合能明显提高生根率, 且植株健壮, 长势好。蝴蝶兰属热带气生兰, 具气生根栽培上要求根部通气良好。现在蝴蝶兰移栽常用基质有水苔、椰糠、蛇木、树皮等, 以水苔效果较好。

综上所述, 用组培方法快繁蝴蝶兰较传统繁殖方法有3 个明显的优点: ①节省育苗用地; ②节省繁殖材料, 提高繁殖系数; ③利用茎尖脱毒培养, 挽救因受病毒侵染而退化的优良品种， 提高质量和欣赏价值。总之组培快繁技术可大大提高生产效益和经济效益。

（5）炼苗
经过长时间的温室培养，必须经过炼苗后才能移栽盆中．炼苗的目的是促使 幼苗适应外界气候环境，使移栽苗的成活率增高。其方法为，在蝴蝶兰成苗时，移栽前5天左右，在要进行移栽的温室内将封口膜打开1/3左右，使幼苗与空气有一定接触。2天后，移栽到驯化温室内，使幼苗完全暴露在空气中，要适当遮阳避免高温和强光直接照射，3天后即可移栽。移栽时将幼苗取出，放在1000倍的多菌灵水溶液中小心洗去根部的培养基，去掉老叶，放入铺有湿报纸的盒子，要注意保湿。栽培基质为经过高温消毒后的苔鲜，用镊子划痕后，夹住幼苗根部，插入至第1轮叶，用手小心压紧，用薄膜覆盖，保持度在21一25℃，相对湿度60％一80%，控制好水分和温度，移栽成活率可达90％以上。

（6）洗苗      经过炼苗后，还要进行洗苗。洗苗需要用20 C左右的温水，认真清洗2～  3遍，保证将培养基等物质冲干净。苗洗净后，要晾干。            （7）移栽与管理

1、栽培基质 ：由于兰花大多数都喜润而畏湿，要求通气通风和适当的水分， 因此，基质要用蝴蝶兰的组织培养与快速繁殖能吸水，又排水，既能透气又有 养分的材料。常用基质有：水苔、泥碳土、椰糠、珍珠岩、木炭等．栽培蝴蝶兰以水苔为最佳，其成分比例为泥炭藓3／4、珍珠岩和木炭1／4。将基质洗净后，用洁净温水浸泡1 d，使其充分吸水膨胀，柔软舒展。移苗前轻轻挤出水苔中的部分水分，以颜色发白为度。

2、温度 多数洋兰适温为15～22 C，而蝴蝶兰的最适温度为2O～28 C；兰花既怕高温，又怕严寒，因此对其温度一定要重视，不宜过高，但也不宜过低。

3、光照      光照、温度和湿度为兰花生长的三要素，它对兰花生长发育的影响是很重要的兰花的需光量也是随种类而异。此外，在兰花的培养中，均需适宜的遮阴。季节不同，遮阴度也不同，春、秋季需遮5O 的光，夏天需遮7O 9／6的光，而在冬季则不需遮。．

4、水分        大多数兰花生于多雨但排水良好的环境中，故性喜湿润而怕过多的水分滞留。但不同种类的兰花对水分的需求并不相同，在栽培时不可混在一起。蝴蝶兰是一种厚叶的附生兰，具有耐旱的生理特点。对于这一类兰花，只要水温适宜，浇灌得法，白天和黄昏浇水都是可以的。浇水应以能湿润根为度，不可多水，即使是水苔失水发白，也不应急于浇水。总之，要适合兰花既怕久旱又忌积水，喜欢湿润，干而不燥的特性。

5、湿度        刚出瓶的兰苗对空气湿度的要求较高，一般应控制在8O ～9O 9／6以上，可在浴器上再加上塑料薄膜，其目的是保持湿度。但是，长期高湿对形成壮苗不利，可逐渐增大覆盖缝隙，3～4 d内便可撤去覆盖物。在生长n，约75 的空气湿度即可满足多数品种的需要。

6、通风       蝴蝶兰的根能从空气中吸取养分，因此，不断更换空气对兰花生长是十分重要的。兰花可每天通风1～2次，但时间不宜过长，以免n起棚内温度和湿度骤变。换气后，待气温回升稳定，用喷雾器喷洒KMnO 液消毒，保温，注意不要使药液滴在叶片上。此外，苗期管理还应注意对苗的施肥、保洁、消毒及病虫害防治。