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文冠果(Xanthoceras sorbifolia Bunge.)，又名木瓜、文登阁、崖木瓜等，属无患子科文冠果属，是中国特有的温带木本油料植物。其种子含油率达30%～60%，种仁含油率高达55%～66%，被誉为“北方油茶。在石油资源日益枯竭的今天，文冠果作为重要的生物质能源树种，由于其耐干旱、耐瘠薄、适应性广的特性，无疑具有更大的发展潜力。 大力发展文冠果，扩大栽培面积，培育原料基地林，要求大量提供优质壮苗，在良种繁育和优良无性系的应用中也需要解决文冠果的组织培养技术问题。文冠果的繁殖技术包括有性繁殖和无性繁殖。在未经任何处理得情况下，文冠果的种子发芽率仅为6%，通过湿沙埋藏和逅浸种等催芽方法可以提高种子发芽率，经高温处理后，发芽率也仅达33%，也有采用低频电流和钴辐射处理的报道，但种子的发芽率仍不高，这就极大地限制了文冠果的繁育；文冠果的嫁接繁殖及扦插繁殖技术也是人们关注和研究的重要问题，但嫁接成活率和扦插生根率都宓汀Ｒ虼耍组织培养必然成为文冠果的重要快速繁育方式而受到越来越多的重视，许多学者已相继就文冠果的组织培养开展了研究，虽然取得一定的成果，但继代增殖困难、增殖系数低、生根难等技术问题仍然没有从根本上得到解决。总结文冠果组织培养研究领域所取得的成果，找到目前辶俚墓丶技术问题，对于明确今后的研究方向和出路，使文冠果组培快繁技术尽快在生产中得到普遍应用并为良种培育奠定基础，具有重要的现实意义和价值。为此，作者从茎段培养、体细胞胚培养和愈伤组织培养三个方面出发就外植体的选择与处理、培养基的配制与激素处理及愈伤组织逵盏加爰檀培养等问题进行全面的总结，以期为促进文冠果组培技术进步抛砖引玉。 1茎段培养 植物茎段培养是指对植物的带有一个以上定芽或不定芽的外植体进行离体培养的技术，目的是进行植物的离体快速繁殖。 1.1茎段培养的外植体选择与处理 用来进行植物茎段培养的外植体，其母株应选择性状稳定、生长健壮、无病虫害的成年植株。通常木本植物多采用带芽茎段、顶芽或腋芽作为快繁的外植体。对茎段而言，取材时期不同，培养的效果也不同。有学者研究表明，如采用完全进入休眠期的枝条，生长就弱小得多。由于腋芽内含有大量的细菌，因此，带芽茎段的消毒较为困难。一般做法是将采回的外植体在自来水中冲洗半小时后，在超净工作台上，依次用75%的酒精消毒10～30s；用无菌水冲洗3次，再用0.1%的HgC12灭菌3～8min后，用无菌水冲洗5～6次，最后按每个茎段上应保留一个腋芽，将茎段切成1.5cm左右后即可接种培养。 l.2茎段培养的培养基配制与激素处理 茎段培养的培养基主要包括启动培养基和生根培养基，两个阶段的培养基培养对象和目的不同，配制和激素处理技术也不同。 1.2.1茎段培养启动培养基的配制与激素处理茎段培养一般以MS作为基本培养基。早在1981年，张桂琴等就报道了以文冠果嫩茎为材料，在MS培养基上附加IAA 1.0～3.0mg/L、IBA 1.0mg/L、BA 1.0mg/L或在MS培养基大量元素减半并附加IBA 3.0mg/L、BA 1.0mg/L，蔗糖浓度为2%～3%的情况下文冠果生长最好。王永明等也报道了文冠果启动的最适培养基为MS附加6-BA 0.5～1.0mg/L，蔗糖3%，琼脂为0.8%，pH值为5.8～6.2。程冉试验了不s激素水平和浓度对文冠果侧芽萌发的影响，筛选出文冠果侧芽萌发的最佳培养基为MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L。王玉珍等在2007年的文冠果组织培养快速繁殖发明专利中，提出文冠果启动培养的最佳启动培养为：在4736.4mg/L的MS基本培养基中添加水解乳蛋白200mg/L，6-BA 2.0～3.0mg/L，AC 0.5～1.0mg/L，食用糖30-40g/L，该方法属于液体培养。 1.2.2茎段培养生根培养基的配制与激素处理张桂琴等经实验研究提出文冠果生根的最佳培养基是在H培养基上附加IBA l.5mg/L、IAA l.0mg/L；或在MS培养基上附加H培养基的叶酸、生物素等。在转接之前，先将小苗基部切口以上0.3cm处在酒精IBA溶液(用95%酒精配制成含0.1%IBA的溶液)中速浸几秒钟。此方法效果较好，发根率能达83%，并且发根早，插后10天即产生肉眼可见的根原点，约经半个月根即伸长；根系粗壮，侧根多。王永明等提出的诱导文冠果生根的培养基为MS大量元素减半，附加IBA 1.0mg/L，蔗糖1.5%，琼脂均为0.8%，pH为5.8～6.2，10天左右即开始发根。程冉试验提出的文冠果生根最佳培养基为：MS+IAA 1.0～2.0mg/L。王玉珍等在文冠果组培快繁专利中提出的文冠果最佳生根培养基为:在2368.22mg/L的MS培养基中添加IBA 0.25～2.0mg/L，NAA 0.5～3.0mg/L,AC 0.5～1.0mg/L,实用糖15～20g/L。其培养温度为(25±2)℃，每日光照12～14h，光照强度为2500～3500lx。 2体细胞胚培养 植物体细胞胚胎发生是指双倍体或单倍体的体细胞在特定条件下，未经性细胞融合，而通过类似于合子胚胎发生的途径，发育出新个体的形态发生过程。体胚发生对植物发育过程中的分子、细胞水平和植物整体水平的研究起着桥梁作用。 2.1体细胞胚培养的外植体选取与处理 体细胞胚培养的外植体来源及其发育阶段是影响体胚发生的重要因素。一般来说，子叶、胚珠、叶片、胚及幼胚和下胚轴、幼花序轴都可作为体细胞胚培养的外植体。 以文冠果种胚为外植体时，在超净工作采希首先将种子用5%KMnO4溶液消毒5～8min后用无菌水漂洗5次，剥去种皮，然后对种胚先用75%酒精处理10s后，用无菌水漂洗3次，再用0.1%HgCl2溶液消毒2min后，用无菌水漂洗5次，最后将种胚切成适宜大小，即可接种。 以文冠果子叶为外植体时，先将文冠果种子用1%洗涤灵水漂洗后用自来水冲洗干净，然后在超净工作台上，用5%的KMnO4消毒8min后用无菌水冲洗5次，剥去种皮，用75%的酒精对子叶进行消毒10s后立即用无菌水冲洗3次，再用0.1%的HgCl2(含0.01%衔-20)消毒2min，立即用无菌水冲洗至无泡沫，切成3～5min3的小块即可接种。 2.2体细胞胚培养的培养基配制与激素处理 对于体细胞胚培养的培养基配制，顾玉红等配制了附加6-BA 0.5mg/L、NAA 0.5mg/L和2%蔗糖的B5液体培养基，在悬浮暗培养10～15天，即可发现球形胚，继续培养，球形胚经过心形胚、鱼雷形胚，发育成子叶状胚。从球形胚发育到子叶胚大约需要10～15天，体细胞胚发生率为80%左右。当形成的子叶胚转移到附加6-BA 0.5mg/L、NAA 0.5mg/L和1%蔗糖的B5液体培养基中，置于弱光下悬浮培养10～15天时，子叶胚便萌发长出白色的根，继续培养后，胚体逐渐转为绿色，形成再生小植株的雏形。植株再生率为60%～70%。2005年该课题组又以种胚为外植体，通过固体和液体悬浮培养技术，筛选出适合文冠果体细胞胚胎发生的多种培养因子，建立了稳定的文冠果体细胞胚胎发生的培养体系。研究结果表明，文冠果的种胚可以通过以下两条途径形成体细胞胚胎。 第一条途径是：文冠果的成熟种胚在B5+2,4-D 1.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L的固体培养基上诱导产生非胚性愈伤组织；非胚性愈伤组织在B5+2,4-D 0.5mgA/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L的培养基上形成A类胚性愈伤组织；A类胚性愈伤组织在B5+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.25mg/L+蔗糖20g/L的培养基上产生球形胚，进一步发育到心形胚和具有明显胚根的、梭形的A类鱼雷胚；A类鱼雷胚在B5+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖20g/L的培养基上发育成A类子叶胚，进而发育成完整的再生植株。 第二条途径是：文冠果的成熟种胚在B5+2，4-D 1.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L的培养基上诱导产生非胚性愈伤组织；非胚性愈伤组织在B5+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+2,4-D 0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L的培养基上形成B类胚性愈伤组织；B类胚性愈伤组织在B5+6-BA 0.5mg/+NAA 0.5mg/L+蔗糖20g/L的培养基上发育产生球形胚，进一步发育到心形胚和无明显胚根的B类鱼雷胚，再进一步发育成无明显胚根、有两片子叶的B类子叶胚；B类子叶胚在B5+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖10g/L的培养基上长出胚根，并由芽生长点纬ぁ⒎只出多片幼叶，进而发育成完整的再生植株。 臧国忠等也以文冠果成熟种子的子叶为外植体，将经固体培养基继代扩增的胚性愈伤组织在含有不同激素水平的B5培养基上进行液体窝，也培养出了完整植株。结果表明，胚性愈伤组织在2,4-D、NAA和6-BA这3种激素为1:1:l的B5培养基上培养14天后，可以获得很多黄白色的球形胚，3种激素水平均为0.5mg/L的处理体细胞胚发生量最大。将球形胚接种在不含2,4-D的分化培养基上，进行体细胞胚的分化再生，黄白色球形胚经心形胚发育成鱼雷形胚，再继续培养5～6天，鱼雷形胚萌发形成予叶形胚，芽呈现绿色，并不断分化幼叶，发a成植株。 体细胞胚培养的外植体均置于恒温震荡器上进行悬浮培养，转速为90～100r/min，培养温度为25士2℃，每日光照时间为12h，培养基的pH为5.8，每7天更换1次培养基。 3愈伤组织培养 植物愈伤组织培养是指诱导植物外植体产生无序生长的薄壁细胞并对其培养的技术。植物的各种器官及组织，都可经培养产生愈伤组织，并能不断继代增殖。 3.1愈伤组织的诱导 对文冠果的愈伤组织诱导也取得了一些进展。高述民等进行的培养基筛选实验，获得了诱导愈伤组织效果较好的MS附加2,4-D 1.0mg/+6-BA 1.0mg/L+NAA 10mg/L培养基。顾玉红等采用了文冠果种胚诱导愈伤组织技术，即种胚组织块接种在MS培养基.中，5天左右开始膨大，7～10天后便可观察到松散、白色、明亮的愈伤组织，将其转移到B5+6-BA 0.5mg/L+2,4-D 0.5mg/L+NAA 0.5 mg/L+2%蔗糖的液体培养基中，培养30天，形成淡黄色、结构紧密的愈伤组织，表面出现颗粒状突起，继续培养到40天，液体培养基中即出现淡黄色小细胞团，随着培养时间的延长，圆形和椭圆形细胞团增多。继代时间相隔7天时，愈伤组织基本不褐化；相隔20天以上时，愈伤组织褐化率为70%～80%，生长很慢，不利于体细胞胚胎的发生，严重时会导致愈伤组织死亡。 臧国忠等在对不激素组合影响文冠果子叶胚性愈伤组织诱导的试验中发现，当外植体接种到2,4-D浓度为2.0mg/L的愈伤组织诱导培养基上，3～5天后切口处出现透明、柔软的愈伤组织，10～15天愈伤增加，种胚块膨大分化，15天过后开始出现黄色颗粒状疏松愈伤，经显微镜检为胚性愈伤组织。2，4-D和6-BA的存在都有利于胚性愈伤组织的诱导，当不添加2,4-D时，愈伤诱导率极低，且生长量非常小。随着2，4-D浓度的提高，愈伤诱导率和生长量显著增加。随着6-BA浓度的增加，白色绒毛状非胚性愈伤减少，水化现象减轻，黄色颗粒状胚性愈伤增加。但当6-BA的浓度达到2.0mg/L时，愈伤诱导率和生长量都明显降低，并且外植体褐化严重。NAA的添加也有利于愈伤的诱导，当2,4-D的浓度为2.0mg/L,NAA浓度为1.0mg/L时，胚性愈伤量最大，而当浓度达至12.0mg/L时，则会出现白色絮状非胚性愈伤组织。 3.2愈伤组织的继代培养 虽然胚性愈伤在附加不同激素组合的培养基上均可增殖，但增殖效果不同。臧国忠等将胚性愈伤组织接种在不同激素组合的MS培>基上培养，结果表明，当激素浓度较低时，增殖率和增殖量都相对较低，而当在原诱导培养基上进行增殖时，增殖率和生长量最大，但胚性愈伤的颗粒状特征退化，显微观察长形非胚性细胞增加；当激素浓度为2,4-D 1.0mg/L，NAA 1.0mg/L和6-BA 1.0mg/L时，愈伤胚性维持良好，增殖率和生长量最优。 4文冠果组织培养存在的问题与发展展望 4.1文冠果组织培养中存在的问题 与其他果树相比，文冠果的组织培养研究难度更大且起步较晚，虽然在培养基的选择配制、外植体筛选以及培养方式等方面取得了一些进展，有些以种胚为外植体的品种己成功获得完整植株。但总的来看文冠果组培研究仍处于初期阶段，现有的研究成果还没有从根本上解决文冠果组织培养中繁殖系数低与生根难的问题，具体表现在下列几方面： (1)基本培养基寮に刂掷嘌≡穹段д，大部分试验选用的是MS、B5及相应的改良培养基，其他种类的培养基较少，激素也是常用的几种，针对文冠果组培中存在的问题有必要扩大培养基和激素的试用范围，以获得更好的效果。 (2)文冠果继代芽生长缓慢，继代增殖较困难，这一限制文冠果生根培养的瓶颈问题还没有解决。 (3)文冠果组培过程中的玻璃化现象和愈伤组织诱导分化成苗分化率低的问题还没有得以有效解决。 (4)目前报道的已经成功的文冠果生根培养基可重复性差，组培苗驯化移栽技术研究还很少。 4.2文冠果组织培养技术研究展望文冠果自身特性决定了其较高的科学研究和商业开发价值，未来一定时期内对文冠果组培技术的实践需求会越来越迫切。为此，应在以下几方面加强试验研究工作： (1)文冠果的启动培养较容易，但继代增殖困难,今后应在借鉴核桃、阿月浑子等木本油料树种的研究经验和模式的同时，加强对文冠果组培生理机制的研究，尤其是内源激素和次生物质代谢方面的生理研究，以便更好地掌握外源激素1种类、数量和配比。 (2)要继续扩大基本培养基、激素和外植体的试研范围，解决增殖系数低、继代芽生长缓慢、生根难等问题，尽早建立快速、稳定、高效并能普遍适用的快繁体系。 (3)探索经根段诱导建立增殖体系的可能性，加速优良品种的推广栽培。 (4)鉴于文s果组培苗生根困难，为迅速提高良种繁殖系数，应开展文冠果良种增殖苗与砧木芽苗或组织培养试管苗显微嫁接的研究
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