| 从红豆杉(TaxusLinn)提取抗癌新药紫杉醇的发现,使该植物名声大振、身价倍增。但是红豆杉繁殖困难,生长缓慢,自然资源极其有限,不能满足人们对紫杉醇日益增长的需求。科学家们采用化学合成、细胞工程及微生物工程等多种技术寻找高效、廉价、优质的紫杉醇生产途径,至今尚未得到理想结果。近年来许多研究表明红豆杉的枝、叶中均有紫杉醇因此,人们十分重视通过栽培法解决红豆杉资源匮乏的问题。美国已选育出适于人工栽培的红豆杉新品种。东北红豆杉(TaxuscuspidataSieb.etZucc.)是东北生长的常绿高大乔木,高20m,胸径可达1m,树皮中紫杉醇含量高于0.01%,但生长慢,分枝少。经多年来人工园林栽培选育出灌木型常绿东红豆杉,树高1～1.5m,分枝多、生长快、耐修剪、树枝可塑性好、易造型,树态瑞丽壮重,是很好的园林观赏常绿树种。经鉴定该树种为东北红豆杉的一个变种,命名为东北矮紫杉(T.cuspidataSieb.etZucc.var.)。如果该树种同样含有紫杉醇,则可大量栽培,每年剪采树枝,既可绿化造林,又可解决紫杉醇的原料问题,但其繁殖同样困难。为此,本研究首次对其进行了茎段腋芽快繁培养、细胞悬浮培养及其紫杉醇产生的研究。 |
茎段腋芽诱导培养 取当年生枝条茎段为外植体,常规消毒、接种、培养。芽诱导培养基为WPM附加0.5～1.0mg/LNAA、0.5～2.0mg/LKT及0.2%水解酪蛋白。腋芽生长成为无菌试管苗后进行试管内微型扦插繁殖。
愈伤组织诱导及细胞悬浮培养 取当年生嫩枝幼茎及幼叶为外植体,常规方法清毒接种及暗培养诱导愈伤组织。愈伤组织诱导培养基为WPM附加2.0～3.0mg/LNAA、1.0mg/LIAA、0.1～0.5mg/LKT。愈伤组织继代培养基为WPM附加1.0mg/LNAA、1.0mg/LIAA及0.1mg/LKT。取生长旺盛、疏松的愈伤组织接种到细胞悬浮培养基中,培养基成分同愈伤组织继代培养基,只是不加琼脂。在25℃光照条件下振荡培养,摇床转速120r/min,振幅2.5cm,悬浮培养细胞生长25d后收获。
当年嫩枝剥离叶片,常规消毒截成0.5～1.0cm茎段后接种在芽生长诱导培养基中,培养3周后,可观察到腋芽开》⒂生长,转入继代培养基中培养4周后腋芽生长成5cm左右的无根试管苗。
:激素的最佳组合为0.5mg/LNAA,0.5～2.0mg/LKT，芽诱导率最高达92.5%,并且在一定浓度范围内芽诱导率与KT浓度增加呈正相关关系;BA不适于矮紫杉芽的诱导培养,其原因是BA可明显引⊥庵蔡搴只;生长素NAA优于IAA,两者配合使用有协同作用;GA对芽的生长无明显作用。此外,腋芽诱导培养中必须添加抗氧化剂,否则外植体自身很快褐化死亡,造成试验失败,在比较多种抗氧化剂的效果中选出添加1.0mg/LPVP(聚乙烯吡咯酮)为最佳。幼茎的愈伤组织诱导率为95.5%,明显高于幼叶(65.4%)。愈伤组织诱导过程中极易发生褐化,特别在继代培养过程中常由于褐化引起多数愈伤组织生长减慢,逐渐死亡。
pH值对悬浮细胞生长的影响 试验中观察到悬浮细胞培养过程中培养基的pH值变化明显,直至引起悬浮细胞系的颜色变黄 ,随着培养时间延长,细胞的生长速率,培养基的pH值逐渐降低。pH值明显影响悬浮细胞的生长,收获时培养基的pH值明显低于配制时的pH值;培养基配制时pH值调至5.7～6.0为适宜范围,最佳pH值为5.7～5.8。 (王关林,方宏筠等)
