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关于蝴蝶兰的组培技术与研究

时间:2020-4-6 浏览数:1283


(一)国内外研究概况

蝴蝶兰原生种有70多种,原产于中国台湾、菲律宾、印度尼西亚、泰国、马来西亚等地。蝴蝶兰属茎较短,长2~3cm,叶大;花茎一至数枚,拱形,有时有分枝,蜡状;花姿优美,颜色艳丽,为热带兰类的珍品;原产亚洲热带,附着在树干或树蕨上生长最为适宜。北方冬季可在高温温室栽培。它属热带气生兰,容易栽培,花形似蝴蝶,花开美妙,色彩丰富,花期长,是近年来最受欢迎的洋兰之一。

蝴蝶兰属于单茎性气生兰,植株上极少发育侧芽,比其他种类的兰花更难进行常规无性繁殖。无菌播种和组织培养是蝴蝶兰快速繁殖的重要手段。有关蝴蝶兰组织培养最初的成功报道是Rotor G.1949)利用花梗腑芽培养出试管苗。大量的研究始于20世纪60年代以后,利用不同的外植体如茎尖(Intuwong et al.1972),茎节(Tse et. Al. 1971),叶片(田中道男1975)等人均可通过诱导原球茎进行试管无性繁殖。蝴蝶兰的组织培养技术相对较为成熟,许多国家已将此技术用于蝴蝶兰组培种苗的工业化生产。综合近20年来国内外的相关资料,主要是在不同外植体的培养条件和培养效果上进行了较多的研究。

1)茎尖培养  将除去叶的茎用流水洗干净,用10%的漂白粉溶液表现灭菌15min,除去叶原基,再用5%漂白粉溶液灭菌10min,用无菌水洗干净。将茎尖及叶基部腋芽切成大小约2~3mm的方块,然后进行接种。

用于蝴蝶兰茎尖培养的基本培养基最常用的有Vacin and WentVW),Knudson CKC)和Murashige and SroogMS)培养基。古川仁朗等人用VW培养基附加15%椰乳进行液体或固体培养。液体培养时,置于摇床以160r/min速度振荡培养,10d左右换新的培养液(培养温度25℃,光照强度2000lx,每天光照16~24h),1个月左右诱导出原球茎,然后将其转移到固体培养基上继续培养。

也可取试管植株直径约0.3mm的茎尖,不需消毒,接种在MS+BA 3mg/L的培养基上进行培养[培养温度(25±2)℃,光照强度1500lx]14d后茎尖膨大、颜色转绿,3个月后,原球茎直径可达6mm(王怀宇1989)。

2)叶片培养  取试管实生苗叶片为外植体,一般实生苗年龄以3~4个月为最好,其诱导率及每个外植体上的原球茎发生的个数最多。对于120d左右苗龄的小苗,可将整个叶片切下直接插入培养基中,效果比将叶片切断好;取自幼叶的外植体,原球茎形成率较老叶好;将叶切断进行培养时,幼叶中间部分原球茎形成率比顶部和基部好;成年植株用叶基部较好;叶切断的大小与诱导率也直接相关,切断太小,存活率低,以0.5cm左右为最好(田中道男1995)。原球茎的诱导培养选用狩野氏(Kyoto)培养基+KT 10mg/L+NAA5mg/L+10%苹果汁或椰乳,也可用MS培养基代替Kyoto培养(Hyponey 3g/L+蔗糖35g/L+琼脂15g/LPH=5.0Hyponey是一种花卉用肥料粉,在美国、日本等国使用普遍,港台商品名为“花宝”,市面上有5种,即花宝1~5号。1NPK的质量比为7:6:19,用途较多,可做培养基,兰花播种和组培上常用)。也有人用Kyoto+BA 10mg/L+NAA 1mg/L+腺嘌呤10mg/L,或Kyoto+BA 5mg/L+腺嘌呤6mg/L。有实验表明以改良VW培养基代替Kyoto,效果较好(培养温度25℃,光照强度500lx,光照时间16h/d)。

3)花梗腋芽及花梗节间的培养  取带腋芽的花梗,消毒后取腋芽接种到培养基上。育苗时,在培养基中加入10%香蕉勺浆。也可用VW液体培养振荡培养一段时期后,产生原球茎,进行切割转移使其增殖,最后分化成苗(Intuwong 1974)。

另一种培养方式是不切下腋芽,取带腋芽的花梗芽,消毒后直接插入Kyoto培养基,或者用MS+BA 3mg/L培养基。两种培养基上的外植体,接种7d左右,侧芽膨大并向外伸长。在Kyoto培养基上,侧芽多长成单株小苗,MS培养基上侧芽萌发形成丛生芽。花梗组织变黑时,应尽快将其转移到新鲜培养基上。将丛生芽切断转移到MS+BA 3mg/L培养基上,进行茎段诱导培养,30d以后可得到增殖丛生芽,不定芽诱导率为50%(王怀宇 1989)。

按林金其(1985)的方法,取不同发育阶段的花梗,消毒后取不同的部位(花梗节间,花蕾,花梗节),斜切成1~1.5mm厚的薄片,接种到斜面固体培养基上,培养基用1.2倍的VW无机盐配方另加肌醇10mg/L,维生素B1B6及烟酸各0.5mg/L,蔗糖2%,琼脂0.8%,附加不同的激素含量,培养温度(26~2)℃,每天光照16h。其结果附加BA1mg/L的培养基诱导效果最好。花梗节间对KT24-D两种激素的诱导不敏感,诱导率为零。另外,发育时间短的花梗其诱导率高,而花梗可见日数在150d以上的其诱导率为零。因此,在花梗培养中,正在迅速伸长的蝴蝶兰花茎是诱导原球茎的最佳材料,当花谢以后,花梗不再适合做外植体。

4)根尖培养  150d苗龄的实生苗根尖培养在B5培养基附加肌醇100mg/L,烟酸1.0mg/L,维生素B61.0mg/L,维生素B110.0mg/L,蔗糖30gPH=5.5的固体培养基上,或者以30r/min的转速进行液体振荡培养时(培养温度25℃,每天光照12h,光照强度2000lx),光照培养与暗培养的诱导率差异不大,在附加KT10mg/LNAA 5mg/L时诱导率最高,可达到70%。原球茎在B5+KT 10mg/L+NAA 5mg/L的培养基上进行增殖培养,6个月以后可形成幼苗(林瑞松 1981)。

尽管通过蝴蝶兰的不同器官或组织都可获得原球茎,以此为起点开展组培快繁。但目前蝴蝶兰种苗工厂化生产中最常用及最有效的材料,仍是杂一代种子的组培瓶苗,其培养方法如下。

(二)有效的培养方法

1、培养基配方

种子萌发培养基  MS+BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L

增殖培养基  MS+BA 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L

生根培养基  1/2MS+IBA 1.5mg/L+2%蔗糖。

2、培养程序

1)取材及灭菌  将生长120d以上,未开裂的蝴蝶兰蒴果剪下,用75%酒精浸泡20s,以0.1%升汞溶液处理5min后,用无菌水冲洗8min,在培养皿中以解剖刀切开果皮使种子散出,放入种子萌发培养基中培养。

2)生长及分化  60d后种子萌发并长成约4cm高,具有2~3片真叶的无菌种子苗。取无菌种子苗的茎尖接种在增殖培养基上,培养30d后基部可长出愈伤组织,产生愈伤组织的百分率达85%以上。继续培养形成丛生的原球茎,其比率可达90%以上。将原球茎切割成小块,仍接种于增殖培养基上,进行增殖培养。40d后每个原球茎可分化形成13~15个不定芽,并且随继代次数的增加,分化形成不定芽的数量增多。经过8~10次继代培养后,还可见到不定芽的分化。

3)生根培养  将增殖培养基中的健壮芽接种到生根培养基上,20d后芽基部长出小根,40d后根变得粗壮,生根率达95%以上。

(三)质量标准及调控技术

进行原球茎扩大繁殖时,将需要转移的原球茎切割成几小块,转入新培养基进行增殖培养,培养一段时间后,再进行切割转移。通过这种方式,原球茎可成倍增长。不需继代的原球茎在增殖培养基或生根培养基上持续培养可分化出芽,并逐渐发育成丛生小植株,将丛生小植株分单株切开,转入生根培养基中,不久小植株便可生根。切离丛生小植株时,基部未分化的原球茎及刚分化的小芽不要丢弃,收集起来置入另一瓶增殖培养基中,作为种苗。一段时间后,将长大的种苗挑出进行生根培养,小苗及原球茎可继续增殖与分化。这样既能得到大量的种苗,又能得到大量不断分化的试管苗。

继代培养基可选用诱导培养基,也可选用KCKyoto等培养基,并适当加入某些附加物及适当调整激素含量以促进原球茎生长。

生根培养基可选用继代培养基,加入一定量复合添加物促进小植株的发育,如香蕉匀浆或椰子汁等,也可加入少量生长素,以促进根的生长。

(四)出瓶苗的过渡管理

将已生根的试管苗置于炼苗室内自然光下培养1周后,取出,洗净根部的培养基,移栽到苔藓或松树皮基质中。注意温度、湿度及水肥管理,成活率可达85%以上。蝴蝶兰为热带气生兰,喜温,但耐寒力强,温度在5℃以下便会死亡,温度低于10℃时,花瓣上易出现黑色斑点(有时为霉菌侵害)。因此冬季注意防寒,室温在15℃以上生长最为适宜。但夏季温度过高(35℃以上),通过不良,会对植株有伤害。日常管理注意光照不宜过强,施肥根据不同生长期的需要,生长旺盛期,多施肥,多浇水,生长停滞期少浇水,少施肥。如管理不善,会出现叶片变黄、植株转弱或叶软无力等现象,此时应及时检查根部是否腐烂,叶片是否出现介壳虫,考虑采取喷药驱虫等措施。

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