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组培中外植体的灭菌

时间:2019-6-24 浏览数:112

从外界或室内选取的植物材料,都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基,便会造成培养基污染。因此,植物材料必须经严格的表面灭菌处理,再经无菌操作接种到培养基上。
1初步处理
将采来的植物材料除去不用的部分,将需要的部分仔细洗干净,如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小,即灭菌容器能放人为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时,冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料,可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。洗时可加入洗衣粉清洗,然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物,除去脂质性的物质,便于灭菌液的直接接触。当然,最理想的清洗物质是表面活性物质-吐温。
2材料的表面浸润灭菌
要在超净台或接种箱内完成,准备好消毒的烧杯、玻璃棒、75%酒精、消毒液、无菌水、计时器等。用75%酒精浸10-30s。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用,加之75%酒精穿透力强,也很易杀伤植物细胞,所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料,如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗,多层鳞片的休眠芽等等,以及主要取用内部的材料,则可只用75%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下,待酒精蒸发后再剥除外层,取用内部材料。
3灭菌剂处理
表面灭菌剂的种类较多,如次氯酸钙、次氯酸钠、升汞、抗菌素等,可根据情况选取1~2种使用,使用浓度根据不同材料也不尽相同。灭菌剂要充分浸没材料,宁可多用些灭菌液,切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。
在灭菌溶液中加吐温-80或Triton X效果较好,这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布,更容易浸入到灭菌的材料表面。但吐温加入后对材料的伤害也在增加,应注意吐温的用量和灭菌时间,一般加入灭菌液的0.5%,即在100ml加入15滴。
最后一步是用无菌水冲洗,冲洗要每次3min左右,视采用的消毒液种类,冲洗3~10次左右。无菌水冲洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。  

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