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植物组织的悬浮细胞培养

时间:2018-3-22 浏览数:12583

悬浮细胞培养是一种将游离的植物细胞悬浮在液体培养基进行培养的方法。悬浮细胞培养有一个重要特点,在悬浮细胞培养过程中,细胞的数量及总质量会不断地增加,经过一定时间,细胞的产量达到最高点,细胞的增长便趋于停止。这时候如用新鲜的培养基进行继代培养,将培养的细胞用新鲜培养基稀释,使培养液中细胞的密度达到与开始培养时相似,于是细胞又会开始新的增殖,其增殖的速率几乎与前次相同,如此往复,表现出一个严格的可重复的周期性变化。这个特点,可提供大量均匀的植物细胞,这就为细胞学研究创造了有利条件。同时,由于悬浮细胞培养的增殖速度快,就可以大规模地培养,就像微生物能应用在发酵工业中一样,生产一些植物特有的产物,这为植物产品工业化又开辟出一条新的路子。
悬浮细胞培养的材料选择,悬浮细胞是从愈伤组织液体培养基中产生的。可以选择一些容易碎裂的愈伤组织,放到液体培养基中,进行振荡培养后,得到悬浮细胞培养物。也可以选择无菌的幼苗或吸涨的胚胎,用匀浆器破碎其柔软的组织,随后将其倒入液体培养基中,形成悬浮细胞培养液,其实这样的悬浮液中,包括着各种细胞和细胞团块,有完整的活细胞、死细胞、细胞碎片组织块。经一定时间的振荡培养后,得到第一代悬浮培养物,其中既有游离的单细胞,又有细胞和组织块。
为了提供下一代培养物中单细胞的比例,应用细口的移液管或注射器,以便只吸出游离的单细胞;也可用纱布或不锈钢网过滤来得到单细胞滤液,作为接种材料。
一般来说,适合于愈伤组织的培养基,可以作为确定悬浮细胞培养的培养基的出发点。但不一定完全适合,还必须研究培养基中生长素与细胞分裂素的配比用量。培养基选择的要求须适合于细胞分散。而且常用的培养基缓冲能力很弱,在悬浮培养过程中,PH值的变动很大。如PH值为4.8~5.4的酸性培养基,在培养过程中会迅速趋于中性。所以在培养基中需加入EDTA(乙二胺四乙酸),以使铁和其他金属离子处于长久的可利用状态。有时加入一些固态缓冲物,如微溶性磷酸钙、不溶性磷酸钙、碳酸钙等,也可以稳定培养基的PH值。
在接种培养中,由于接种量的不同,对细胞培养基的要求也有所不同。接种量越小,细胞生长所需的条件也越严格。所以在悬浮细胞培养时,每一个培养器中应接种足够数量的细胞。一般而言,起始细胞的密度应为0.5~(0.25×105)个/mL。
在悬浮细胞培养过程中,细胞数目会不断地增长,其变化规律基本上呈一条S形曲线。开始称延迟期,细胞很少分裂。接着细胞数目迅速增长,而增长的速率保持不变,称为指数生长期。随后,细胞数目增长加快,进入对数生长期。以后,细胞的增长又逐渐减慢,称为减缓期。最终细胞的增长完全停止,称静止期。那么究竟什么时候继代培养好?经试验继代培养有一定的伸缩余地,有的一达到静止期,马上需要继代培养;有的则在静止期之前。一般来说,在悬浮细胞培养中以静止期之初继代培养为好。因为,此时细胞增长稳定,便于测定计量细胞密度,得到一种较好的起始密度值。同时,此时培养基中的营养成分几乎耗尽,也需要及时继代培养。
细胞计数,计量细胞密度的常用方法是用血球计数板来测定。例如上海医用光学仪器厂生产的血球计数板,其结构为板槽深度0.1mm,在每个划线区由“井”字形的粗线分成9个区域,每个区域长1mm,宽1mm。

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