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植物组织培养实务--外植体的选择与消毒

时间:2010-12-31 浏览数:3698
    1、外植体的选择
    外植体是指植物组织培养中的各种接种材料。从理论上讲,植物细胞都具有全能性,能够再生新植株,任何器官、任何组织、单个细胞和原生质体都可以作为外植体。但实际上,不同品种、不同器官之间的分化能力有巨大差异,培养的难易程度不同。为保证植物组织培养获得成功,选择合适的外植体是非常重要的。
   (1)选择优良的种质及母株
无论是离体培养繁殖种苗,还是进行生物技术研究,培养材料的选择都要从主要的植物入手,选取性状优良的种质、特殊的基因型和生长健壮的无病虫害植株。尤其是进行离体快繁,只有选取优良的种质和基因型,离体快繁出来的种苗才有意义,才能转化成商品;生长健壮无病虫害的植株及器官或组织代谢旺盛,再生能力强,培养后容易成功。
   (2)选择适当的时期
组织培养选择材料时,要注意植物的生长季节和生长发育阶段,对大多数植物而言,应在其开始生长或生长旺季采样,此时材料内源激素含量高,容易分化,不仅成活率高,而且生长速度快,增殖率高。若在生长末期或已进入休眠期时采样,则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应。花药培养应在花粉发育到单核靠边期取材,这时比较容易形成愈伤组织。百合在春夏季采集的鳞茎、片,在不加生长素的培养基中,可自由地生长、分化;而其他季节则不能。叶子花的腋芽培养,如果在1月至翌年2月间采集,则腋芽萌发非常迟缓;而在3-8月间采集,萌发的数目多,萌发速度快。
   (3)选取适宜的大小
培养材料的大小根据植物种类、器官和目的来确定。通常情况下,快速繁殖时叶片、花瓣等面积为5mm2,其他培养材料的大小为0.5~1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料,则应更小。材料太大,不易彻底消毒,污染率高;材料太小,多形成愈伤组织,甚至难以成活。
   (4)外植体来源要丰富
为了建立一个高效而稳定的植物组织离体培养体系,往往需要反复实验,并要求实验结果具有可重复性。因此,就需要外植体材料丰富并容易获得。
   (5)外植体要易于消毒
在选择外植体时,应尽量选择带杂菌少的器官或组织,降低初代培养时的污染率。一般地上组织比地下组织消毒容易,一年生组织比多年生组织消毒容易,幼嫩组织比老龄和受伤组织消毒容易。
   2、外植体取材的部位
    植物组织培养的材料几乎包括了植物体的各个部位,如茎尖、茎段、花瓣、根、叶、子叶、鳞茎、胚珠和花药等。
   (1)茎尖
   茎尖不仅生长速度快,繁殖率高,不容易发生变异,而且茎尖培养是获得脱毒苗木的有效途径。因此茎尖是植物组织培养中最常用的外植体。
   (2)节间部
   大部分果树和花卉等植物,新梢的节间部是组织培养的较好材料。新梢节间部位不仅消毒容易,而且脱分化和再分化能力较强,因此是常用组织培养材料。
   (3)叶和叶柄
   叶片和叶柄取材容易,新出的叶片杂菌较少,实验操作方便,是植物组织培养中常用的材料。尤其是近年在植物的遗传转化中,以叶片为试验材料的报道很多。
   (4)鳞片
水仙、百合、葱、蒜、风信子等鳞茎类植物常以鳞片为材料。
   (5)其他
   种子、根、块茎、块根、花粉等也可以作为植物组织培养的材料。
但是,不同种类的植物以及同种植物不同的器官对诱导条件的反应是不一致的。如百合科植物风信子、虎眼万年青等比较容易形成再生小植株,而郁金香就比较困难。百合鳞茎的鳞片外层比内层的再生能力强,下段比中、上段再生能力强。选取材料时要对所培养植物各部位的诱导及分化能力进行比较,从中筛选出合适的、最易表达全能性的部位作为为植体。
   3、外植体的消毒
    植物组织培养用的外植体大部分取自田间,表面上附着大量的微生物,这是组织培养的一大障碍。因此在材料接种培养前必须要消毒处理,消毒一方面要求把材料表面上的各种微生物杀灭,同时又不能损伤或只轻微损伤组织材料而不影响其生长。因此,外植体的消毒处理是植物组织培养工作中的重要一环。
   (1)常用的消毒剂
   常用的消毒剂如下表所示。理想的消毒剂应具有消毒效果好,易被无菌水冲洗掉或能自行分解,对材料损伤小,对人体及其他生物无害,来源广泛,价格低廉。
 
常用消毒剂的使用方法及效果

消毒剂
使用浓度/%
消毒时间/min
去除的难易
消毒效果
对植物毒害
升汞
0.1~0.2
2~10
较难
最好
剧毒
酒精
70~75
0.1~1
次氯酸钠
2
5~30
很好
漂白精粉
饱和溶液
5~30
很好
低毒
过氧化氢
10~12
5~15
最易
新洁尔灭
0.5
30
很好
很小
硝酸银
1
5~30
较难
低毒
山农一号/(mg.L-1)
0.4~5
30~60
无毒

    ①酒精
    酒精是最常用的表面消毒剂,以70%~75%酒精杀菌效果最好,95%或无水酒精会使菌体表面蛋白质快速脱水凝固,形成一层干燥膜,阻止了酒精的继续渗入,杀菌效果大大降低。
    酒精具有较强的穿透力,使菌体蛋白质变性,杀菌效果好。同时它还具有较强的湿润作用,可排除材料上的空气,利于其他消毒剂的渗入。但酒精对植物材料的杀伤作用也很大,浸泡时间过长,植物材料的生长将会受到影响,甚至被酒精杀死,使用时应严格控制时间。但酒精不能彻底消毒,一般不单独使用,多与其他消毒剂配合使用。
   ②升汞
   又称氯化汞,Hg2+可以与带负电荷的蛋白质结合,使蛋白质变性,从而杀死菌体。升汞的消毒效果极佳,但易在植物材料上残留,消毒后需用无菌水反复多次冲洗。升汞对环境危害大,对人畜的毒性极强,使用后应做好回收工作。
   ③次氯酸钠
   次氯酸钠是一种较好的消毒剂,它可以释放出活性氯离子,从而杀死菌体。其消毒能力很强,不易残留,对环境无害。但次氯酸钠溶液碱性很强,对植物材料也有一定的破坏作用。
   ④漂白粉
   漂白粉的有效成分是次氯酸钙[Ca(ClO)2],消毒效果很好,对环境无害。它易吸潮散失有效氯而失效,故要密封保藏。
   ⑤过氧化氢
   也称双氧水,消毒效果好,易清除,又不会损伤外植体,常用于叶片的消毒。
   ⑥新洁尔灭
   这是一种广普表面活性消毒剂,对绝大多数植物外植体伤害很小,杀菌效果好。
   (2)消毒方法
   ①茎尖、茎段及叶片等的消毒
    消毒前先对植物组织进行修整,去掉不需要的部分,然后用自来水冲洗。对于一些表面不光滑或长有绒毛的材料,可用洗涤剂清洗,必要时用毛刷充分刷洗,硬质材料可用刀刮。
   消毒时在超净台上操作,先用70%酒精浸泡10~30s,以无菌水冲洗2~3次,然后按材料的老、嫩和枝条的坚实程度,分别采用2%次氯酸钠浸泡10~15min或用0.1%升汞浸5~10min。消毒时要不断搅动,使植物材料与消毒剂充分地接触。若材料有绒毛,最好在消毒液中加入几滴Tween-20,最后用无菌水冲洗3~5次。
   ②果实及种子的消毒
    先用自来水冲洗10~20min,再用酒精迅速漂洗一下。果实用2%次氯酸钠浸10min,后用无菌水冲洗2~3次。种子则先用10%次氯酸钠浸泡20~30min,难以消毒的可用0.1%升汞消毒5~10min。对于种皮太硬的种子,也可预先去掉种皮,再用4%次氯酸钠浸泡8~10min。
   ③花药的消毒
   用于组织培养的花药多未成熟,其外面有花萼、花瓣或颖片保护,处于无菌状态。消毒时将整个花蕾或幼穗用70%酒精浸泡数秒钟,然后用无菌水冲洗2~3次,再在漂白粉中浸泡10min,最后用无菌水冲洗2~3次。
   ④根及底下部器官的消毒
   由于这类材料生长于土壤中,表面带菌量大,消毒较为困难。可先用自来水冲洗,软毛刷刷洗,用刀切去损伤及污染严重部位,再用酒精漂洗后,置于0.1%升汞中浸5~10min或2%次氯酸钠中浸10~15min,最后用无菌水冲洗3次。
   在操作时要根据材料的大小、幼嫩、质地等差异做出判断后,再选择适宜的消毒剂种类、浓度和消毒时间,切不可生搬硬套。消毒的最佳效果应以最大限度地杀死材料上的微生物,而又对材料的损伤最小为好。

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