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植物无糖组培技术的研究应用

时间:2009-3-26 浏览数:5720
  一、植物无糖组培的概念及意义

    植物组培快繁技术比一般的传统农业常规繁殖技术具有更多的优越性,已经在园艺、农业、林业和医药等方面广泛地应用。植物组培快繁技术从理论上计算,繁殖率很高,扩繁速度可比常规方法快数万倍到数百万倍。操作过程中的污染损失、材料变异、生长不良、培养瓶内植株的生根率低、驯化期间较高的死亡率等,把每一步的损失加起来,看到的数字是惊人的。因此植物组培快繁技术在商业化的应用中仍然受到一定限制的重要原因。因此,迫切需要从理论研究和生产实践上,尽快地提高和改进植物组培快繁技术中的制约环节。以减少培养过程中的污染;提高过渡苗的成活率;提高产品的质量和产量;降低生产成本;获得更佳的经济效益。

    在植物组织培养中,小植株的生长方式有三种:一是植物靠光合作用进行自然生长(自养);二是植物体靠培养基中的糖进行异养生长(异养);三是植物既靠培养基中的糖又靠人工光照,同时进行异养和自养生长(兼养)。现在常规的植物组培快繁技术大多数是以第三种方式进行。在异养和兼养的条件下,小植株主要依靠培养基中的糖作为碳源,极易引起微生物的污染。为了减少微生物的污染,封闭的、小的容器必须被使用。在小的培养容器中,环境控制系统的开发是困难的;由于培养基中糖的存在,导致叶片表层结构发育差,气孔开闭功能不强,叶片小,叶绿素含量降低,最终抑制和降低了小植株的光合作用能力;与植株自然生长差异悬殊的容器内环境,还导致植株生理、形态上的一定紊乱,难以适应的种类会生长发育延缓或死亡;有的种类会出现植株生长细弱,叶片舒展度差,生根不良,引起驯化阶段植株较高的死亡率;为了解决这些问题,必须依靠使用植物生长调节剂,植物生长调节剂的使用往往导致畸形和变异。

    现代的研究已经证明,培养容器中的小植株都有相对高的光合能力。在光独立培养及无糖条件下,也可能比在异养和兼养的条件下生长得快。原有技术高成本的原因之一,是培养基中糖的存在,糖的成本占培养基成本的12%~15%(按每瓶培养基加30g糖计),同时常规植物组培快繁生产过程中,出现的高污染率,也由于培养基中糖的存在而引起。在此论点下,植物组织无糖快繁技术的概念被提出来了。

    植物组织无糖快繁技术与常规的植物组织快繁技术不同之点在于改变了碳源的供给途径,即改变培养基成分,培养基中不再含有糖;组培苗由原玻璃瓶内养殖改为箱式大容器培养;输入可控制量的CO2气体作为碳源。并通过控制培养环境因子,促进植株光合作用速率,使之由异养型转变为自养型。因而可使植株长势良好,生物量较有糖培养的显著增加,污染率明显降低。

    二、植物无糖组培技术的研究及应用现状

    20世纪80年代末期,日本大学园艺学部环境调节工学研究室古在丰树教授应邀帮助一位从事观赏园艺植物组培快繁生产的朋友,解决生产中常出现的组培苗黄化、生根差、污染率高等问题时,将大田温室建设中环境控制的原理引入到组培室改造应用中。首次提出了无糖培养微繁殖和闭锁型种苗生产的理念。经过大量实验研究证明,目前这项研究成果已成为世界领先的先进技术。世界上许多国家的生物学学者纷纷到古在丰树教授的研究室学习这一新技术,其中美国、英国、韩国等国家已将该项技术应用于生产。尤其对闭锁型苗生产的研究和应用非常热门。闭锁型苗生产指的是在一个封闭的系统中,控制其营养液、光照、温度、湿度、CO2及各种气体浓度,为植物的生长创造最佳的环境条件。所产出的种苗健壮、整齐、品质好,生产周期短,能直接移植到大田,不需要再经过驯化阶段。美国和日本的研究报道都说明:闭锁型苗的生产成本低于原有温室种苗的生产成本。此项技术还能有效地防止农药、化肥污染,节约土地资源、能源,保护生态环境。

    中国国家外专局和昆明市科委邀请古在丰树教授到昆明进行学术讲座,将环境控制技术传播到昆明。并于1997年列入昆明市重点科技计划,同年9月至2000年12月昆明市环境科学研究所受国家外专局和昆明市科委的委托承担了“无糖组织培养技术的引进及应用研究”和“无糖箱式组织培养技术示范”课题。通过3年的试验研究和生产示范,课题进展顺利取得很好的效果。他们结合国情,开发了大量的培养容器和CO2强制性供气系统。该系统可对CO2浓度进行调配、消毒,并成功地应用于生产。对非洲菊、康乃馨、满天星、情人草、勿忘我、彩色马蹄莲、洋桔梗、草莓、菠萝、马铃薯、甘蔗、甘薯等多种植物进行了无糖快繁研究,并开展了年产50万株商品苗的技术示范。实现了优质苗生产,技术水平达到国内领先。

    试验示范结果证明无糖组培快繁技术是一项很有生命力的新技术,是常规组培技术的一项革新。无糖组培快繁技术与原有技术相比,具有以下显著特点。

    (1)通过人工控制,可动态调整优化植物生长环境,为种苗繁殖生长提供最佳的CO2浓度、光照、湿度、温度等条件,促进了植物的生长发育,苗齐、苗壮、培养周期缩短40%以上。

    (2)大幅度减少植物组培快繁生产过程中的微生物污染。

    (3)由于植株的生根率、成苗率、种苗质量显著提高,使组培种苗驯化期间的成活率大幅度上升,并且复杂的驯化过程得以简化。

    (4)节省投资,降低生产成本。示范生产结果表明综合成本平均降低了30%。

    (5)组培生产工艺简单化,流程缩短,技术和设备的集成度提高,降低了操作难度和劳动作业强度,易于在规模化生产中推广应用。

    植物无糖培养技术简介

    一、无糖培养的环境控制

    (一)无糖培养室的设计

    常规的植物组织快繁培养室是半开放型的,有门窗。目的是使自然光能够通过门窗进入培养室加于利用。然而,阳光在带进光线的同时,也带进了热量、病菌和微生物,增大了污染和空调的耗电量。受天气变化的制约,从门窗进来的是有限的,也是不均匀和不稳定的,太阳光波长的变化是300~3000nm。但植物的光合作用可用的波长是400~700nm。因此进入培养室的太阳光能被植物利用的极少。

    为了既节约能源,又能使环境控制的效果更好,无糖培养室采用了闭锁型。窗口全封闭,门也尽可能密封;墙内加入保温材料,墙面光滑,防潮反光性好;便于清洁灭菌,进行全方位的人工环境控制,不受由天气变化引来的温度、湿度、气体浓度等变化引起的任何外界干扰。并有效地防止病菌、微生物的进入,为植物工厂化周年生产提供最佳条件。国外的许多试验表明:闭锁型苗生产能有效地降低空调的耗电量。在我们新建的20m2无糖培养室中,耗电量周年基本稳定,空调每天7kW•h,照明平均每天28 kW•h,气泵每天2 kW•h;每月10kg液态CO2。对整个培养室的种苗产量和运行成本能地行有效的控制和核算。

    (二)无糖培养的容器

    培养容器是小植株生长的场所,是植物组织培养最重要的因素。一个培养容器可以想像为一个小的温室或培养室,培养在容器中的外植体可以看作是一个缩小了植株茎断或植株的某一部分。当然,它们在容器中的生长环境和处于自然环境中温室内条件是不同的,在温室中常常存在病菌、病毒感染等问题。而在培养瓶中,病菌、病毒感染等因子已受到严格控制。

    在常规的植物组织培养中,由于培养基中糖的存在,一般是采用小的培养容器以防止微生物的污染。因此,容器中的植株生长在高的相对湿度、低的光照强度、稀薄的CO2浓度的条件下,而且培养基中高浓度的糖和盐以及植物生长调节剂,有毒物质的累积和微生物的缺乏等,这些条件常常降低植株的蒸发率、光合能力、水和营养的吸收率;而小植株的暗呼吸却很高,结果引起小植株生长细弱瘦小。

    无糖组织培养,最重要的优势就在于培养基中除去了糖,污染率降低了。从理论上讲,培养基中去除了糖后,大型的培养容器是可以使用的。因此,为了改善小植株的生长状况,必须研制新型的培养容器。培养容器的设计要考虑透光性、空气湿度、气体的流动、容器的散热等因素。因为容器封闭的方式,影响气体的成分及光照强度,完全密封的容器及弱光照容易产生玻璃化苗。昆明市环境科学研究所开发了一种大型的培养容器,用有机玻璃制作,尺寸是根据日光灯管的长度和培养架的宽度确定的,体积130L,培养面积5610cm2,可放在培养架上多层立体式培养。目的是为了有效地利用光源和培养室面积,进一步降低能耗、投资和运行成本。

    实践证明:这种新型的培养容器,透光性好,与常用的培养瓶相比提高了10%~15%的光能利用率;便于气体交换,气体分布均匀、利于植株对CO2的充分吸收;能够促进植株更快地健壮地生长发育,减少生理和形态的紊乱,植株健壮;去瓶驯化过程变得简单甚至可以省去;而且简化操作程序,较大幅度地降低生产成本。但此种培养箱只适用于无糖光独立组织培养。因为有糖培养随着培养容器的增大污染率随之上升。而无糖培养微繁殖可适应任何类型及大型的培养容器。

    (三)利用反光设施提高光能利用率

    来自不同光源的光的分配是不同的。光能控制植株的形态。在微繁殖应用中,白色的荧光灯是主要的光源,因为光谱基本符合培养的要求。然而培养容器内外的光照强度不同。在培养容器中光照强度依赖于容器及封闭的类型和容器摆放的位置。

    培养室用于照明电能的消耗量占总用电量的70%,而常规组培技术忽视了对光利用率的研究。通常使用的培养室非常明亮,很多光不是照射到植株上,而是照射到培养室的墙壁上,小植株的根部,一部分光源被白白浪费。从而增加了用电的成本。采用透光性中的材料制作培养容器和反光铁片等,可最大限度地把光能集中用于小植株上,显著地提高光能的利用率。据测定2支日光灯,不设置反光设施,光照强度为2200lx,增加反光设施后为3400lx;4支日光灯不设置反光设施,光照强度为4300lx,增加反光设施后为6500lx,提高了50%的光能利用率。

    (四)无糖培养室的CO2供给系统

    无糖培养快繁技术的一个重要特征就是培养基中的糖被除去,也是与常规植物组培技术最大的差异之处,由CO2代替糖作为植物体的碳源。在常规的植物组织培养系统中,糖例如蔗糖、果糖、葡萄糖和山梨糖,被看作是小植株生长必不可少的物质,是异养生长培养中植株的碳水化合物来源。在自然界中,植株对碳水化合物的需要和来源,依赖于从空气中获取CO2,并与植物体内的水分通过光合作用产生。由此推论,只要满足植物组织培养容器内的光通量和CO2浓度,也就能促进容器内的小植株达到同样、甚至更高的光合作用速度。但常规植物组培瓶内的培养基中加入了糖,糖对小植株的光合成速率有消极作用,而造成了试管苗的低光合成率。在大多数有糖培养中,植株吸收的蔗糖量仅占加入培养基中蔗糖的2%~8%。

    因此去除培养基中的糖,有助于减少培养基中由微生物污染造成的试管苗损失;避免由植物生长调节剂的使用造成的部分组培苗生长发育异常;降低试管苗驯化过程的难度,通过显著提高试管苗过渡驯化的成活率,而大幅度地降低组培苗的生产成本。国外大量的资料表明,在同进输入CO2的条件下,无糖培养的光合速率大于有糖培养的光合速率。输入CO2的植株干重增加快,无糖培养的光合速率是有糖培养的3~8倍。

    用CO2代替糖作为培养基中植物体的碳源,单靠容器的CO2浓度远远不能满足植株生长的需求。如果在补光期内提高容器中的CO2浓度,将极大地增加纯光合速率,促进植物的生长和发育。但人为CO2的输入会引起培养容器内各种气体浓度、气体扩散和湿度等一系列的变化,从而影响到植株的生长和发育,因此,如何满足植株最适需求的高CO2高供给植株吸收,是非常重要的技术关键。一般而言,输入的方式有两种,自然换气和强制性换气。自然换气是培养室的空气通过培养容器的微小的缝隙或透气孔进行培养容器内外气体的交换;强制性换气是指利用机械力的作用进行培养容器内外气体的交换。在强制性换气条件下生长的植株,一般都比自然换气条件下生长的要好。

    国内现在较为成熟的CO2输入系统是采用箱式无糖培养容器和强制性管道供气系统,供气系统由CO2浓度的控制,混合配气装置、消毒、干燥、强制性供气装置、供气管道等构成。其运行结果可适合于工厂化生产,CO2浓度、混配气体的构成、气体的流速、气体的灭菌都容易控制。至于通入CO2混合气体的次数、流速及浓度等,要根据培养的植物种类及其生长状况、培养周期而定。

    二、无糖培养的技术原理

    在植物无糖组织培养中,容器内的气体交换、CO2浓度与光照强度的相关性、培养基的种类、植物激素的应用、容器内的湿度和温度,在不同种类小植物生长发育过程中扮演着重要的角色。它们是小植株的微环境。极大的影响着植株的纯光合速率、植株的品质和培养周期,从而影响到生产成本。

    (一)无糖培养容器内的气体交换

    每小时空气的换气次数是容器的一种自然现象,它不随时间变化。但容器中的气体浓度会随植物、培养基以及容器外的气体浓度而变化。培养容器气体交换特征最好的表达方式是每小时空气的换气次数E(Kozai 1986)。

    换气次数E 的定义是:容器每小时空气的交换率除以容器的体积,单位为次/(h•L)

    式中:T是时间间隔从0~T(h);K是在时间初期的气体浓度(μmol•mol-1);K0在时间0的气体浓度(μmol•mol-1);Kou容器外的气体浓度(μmol•mol-1);V是容器的体积(L)。

    容器的体积是一个容器的物理特征,基本是不变的。如果是封闭容器的某一部分使用透气次数能提高3~6倍。

    试验表明:培养容器的空气的换气次数极大地影响着容器内的气体和液体、植株之间水的交换,严重影响植株的生长发育和品质。它在植物的生长发育中起着重要的作用,因为如果培养容器换气次数低,则容器内的湿度很高,它能抑制蒸发,导致叶片发育异常,产生玻璃苗。容器内的湿度依赖于培养容器的换气次数,增加换气次数也能提高容器中空气的流通速度。容器周围的气流速度、容器的大小和形状、容器内的植株及培养基表面的温度对气流的吸收有影响。容器外的环境能间接地或直接地影响容器内的环境,即容器内的环境可以通过气体交换直接和外环境相联系,外环境间接地影响到容器内的环境。外环境对内环境影响的程度,依赖于两环境之间气体的交换。换句话说,容器的换气次数决定着容器内外气的交换,影响容器的内环境,从而影响小植株的生长发育。

    (二)CO2浓度与光照强度的相关性

    碳素营养是植物生命的基础,植株靠吸收CO2和光能进行光合作用。要提高植株的纯光合速率,促进植株的生长和发育,就必须提高CO2浓度和加强光照。在兼顾促进植物生长发育和生产成本的前提下,对不同的植物、不同的光照强度和CO2浓度进行多次试验的基础上。将试验结果总结如下。

    (1)含有叶绿素的外植体自身具有光合能力,最初外植体的叶面积大,有助于植株光独立培养的建立。

    (2)在光照期间,通过封口膜供给的外部不充足的CO2(自然换气),会限制植物的光合作用。

    (3)利用机械力(强制性换气)把CO2输入到大型的培养容器中,可以充分保证植株对CO2的需求,显著促进植物的生长发育。

    (4)在常规的组培技术中,植株被迫进行异养和兼养,在低的CO2浓度下,提高光强度对增加植株的纯光合速率作用不大。

    (5)在自养的条件下,高水平的CO2浓度和强光照,可显著提高植株的纯光合速率,加快植株生长发育,缩短组培苗的培养周期。

    (6) CO2浓度和光照强度是植物进行光合作用的两个最重要的因素,两者之间的量必须配合好。在5000~6000lx的光照条件下,C3植物的CO2浓度以294mg/m3为宜;在5000~8000lx的光照条件下,C4植物以392~588mg/m3为宜。

    (三)无糖培养的培养基

    在植物组织培养中,培养基质的种类是十分重要的,它直接影响植株根区的环境及植株的生根率。疑胶状的特质如琼脂、卡那胶通常被用作组培苗的培养基质。但植株的根系在琼脂中的发育一般瘦小且脆弱,当移植到过渡培养的土壤时容易被损坏。事实上,多孔的无机材料,例如塑料泡沫、蛭石、珍珠岩、岩棉、陶粒、纤维素等也能用作培养基质。我们的试验表明,多孔的无机材料比凝胶状的物质好,因为多孔的无机材料与价格昂贵的琼脂及其他凝胶状的物质相比,生长量增加而生产成本降低。因为多孔(测量体积空气百分率),空气扩散系数高、植株的根区环境中有较高的氧浓度,从而促进小植物的生长。在供试的无机材料基质中、蛭石比珍珠岩和砂好。

    (四)无糖培养中植物激素的应用

    植物激素是植物体内自身产生的一种特殊的化学物质,它控制酶的产生,从而调节与控制植物的生长发育。一般植物体内存在的天然激素很少,在很低的浓度时,就能对植株的生长发育起到调节作用。但在常规的有糖培养技术中,由于小植株生长纤细瘦弱,植物激素就显得更为贫乏,必须人为加入植物生产调节剂,以促进植株的分化和生根。我们的试验表明:在无糖培养微繁中,由于植株生长健壮,在生根培养阶段,加入生长激素和不加生长激素对植株的生根率没有显著的影响。但在无糖培养的增殖阶段,由于初期外植叶面积较小,需加入细胞分裂素以促进植物细胞的分裂。

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